Визуализация формирования и закрытия фагосом на основе микроскопии TIRF

Возьмем стеклянную чашку со стеклянным дном с полимерным покрытием, содержащую прилипшие к ее поверхности эритроциты или эритроциты, опсонизированные IgG.

Поместите чашку на предметный столик флуоресцентного микроскопа с полным внутренним отражением, поддерживая в нем физиологическую температуру.

Добавьте макрофаги, содержащие флуоресцентно меченые цитоплазматические пептиды, которые связываются с полимеризованным актином, облегчая визуализацию цитоскелета.

Во время визуализации направляйте лазерный луч под углом, превышающим критический угол, что приводит к внутреннему отражению и генерации затухающих волн в точке контакта.

Затухающие волны избирательно освещают флуорофоры на границе стекло-образец, что позволяет визуализировать фагоцитоз в режиме реального времени.

Fc-рецепторы макрофагов связываются с IgG-опсонизированными эритроцитами, вызывая скопление рецепторов вокруг области контакта.

Кластеризация запускает внутриклеточные сигнальные пути и активацию ГТФазы, стимулируя полимеризацию актина и рекрутирование динамина, образуя псевдоподы.

Псевдоподы простираются вокруг эритроцитов, образуя фагоцитарную чашу.

В конце концов, кончики псевдоподов сливаются. Накопленный динамин опосредует отделение фагосом от клеточной мембраны, интернализуя опсонизированные эритроциты.

Для нековалентной фиксации SRBC налейте по 2 миллилитра IgG-опсонизированных клеток в каждую из посуд, покрытых полилизином, и центрифугируйте образцы в центрифуге с качающимся ротором. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте частицы один раз 2 миллилитрами PBS плюс 10% BSA.

Затем инкубируйте частицы с 2 миллилитрами свежего PBS плюс 10% BSA в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего последует три промывки 2 миллилитрами PBS. После последнего мытья замените PBS 2 миллилитрами бессывороточного микроскопического средства 37 градусов Цельсия.

Поместите чашку с кодом SRBC на предметный столик микроскопа. Затем соскребите интересующие трансфицированные клетки со дна чашки для культивирования и несколько раз пипетируйте клетки, чтобы получить суспензию одиночных клеток. Добавьте трансфицированные клетки в чашку, покрытую SRBC.

Запустите программное обеспечение для сбора данных в реальном времени. Найдите клетку, которая экспрессирует флуоресцентно помеченные белки, и отрегулируйте положение чашки так, чтобы интересующая вас клетка находилась в центре поля. Получите 500 изображений под разными углами от 0 до 5 градусов с шагом 0,01 градуса на одной длине волны возбуждения.

Чтобы определить критический угол для полного отражения падающего света на границе стекло-среда и генерации затухающей волны, откройте последовательность изображений в соответствующем программном обеспечении для обработки изображений. Выберите интересующую область в ячейке с равномерной флуоресценцией.

Затем на вкладке Изображение выберите Стеки и построите профиль оси Z. Построить график средней интенсивности флуоресценции по оси Z, измеренной в интересующей области, с функцией углов по оси X. Любое значение угла по оси x, превышающее критический угол, может быть использовано во время сеанса микроскопии для получения сигнала TIRF.