Клеточный анализ для оценки поглощения тау-белка микроглией

Начните с многолуночной пластины с плоским дном, содержащей прилипшие мышиные микроглии — фагоцитарные клетки мозга.

Введите бессывороточную среду, содержащую иммунокомплексы. Эти комплексы состоят из антител, прикрепленных к фосфорилированным агрегатам тау-белка, которые образуются при некоторых нейродегенеративных заболеваниях.

Агрегаты Tau помечены pH-чувствительным зеленым флуоресцентным красителем.

Во время инкубации эти иммунокомплексы взаимодействуют с Fc-рецепторами клеток микроглии, способствуя их поглощению.

Эта эндосома, содержащая иммунокомплекс, сливается с лизосомой, образуя эндолизосому. Кислая среда эндолизосомы заставляет молекулы красителя флуоресцировать.

Промойте для удаления неинтернализованных иммунокомплексов.

Обработайте раствором трипсин-ЭДТА для отделения клеток.

Перенесите клеточную суспензию на U-образную донную пластину, расположенную над льдом, чтобы стабилизировать эндолизосому. Гранулируйте клетки и выбросьте надосадочную жидкость.

Промойте и повторно суспендируйте элементы с помощью буфера FACS.

Используя FACS, определите отдельные живые клетки и количественно оцените интенсивность зеленой флуоресценции для оценки поглощения тау-белка микроглией.

В первый день эксперимента подготовьте клетки BV-2, предварительно промыв их 1x PBS в колбе, в которой они были культивированы. Затем инкубируйте их с 0,05% трипсина ЭДТА при 37 градусах Цельсия и 5%_CO2 до тех пор, пока они не отделятся от колбы. Ресуспендируйте клетки в культуральной среде путем пипетирования вверх и вниз от 3 до 5 раз.

Подсчитывают клетки и получают клеточную суспензию с конечной концентрацией 100 000 клеток на миллилитр в культуральной среде, содержащей 200 мкг гепарина на миллилитр. Добавьте 250 микролитров этой клеточной суспензии на лунку в 96-луночный планшет с плоским дном для культуры тканей. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5%_CO2 в течение ночи.

После размораживания на льду предварительно приготовленных агрегатов pH-красителя Tau разбавьте их в 65 микролитрах в расчете на кондицию бессывороточной среды с получением 500-наномолярного раствора. Разведите антитела в 65 микролитрах бессывороточной среды для достижения удвоенной желаемой концентрации. Смешайте агрегаты красителя pH и антитела в 96-луночной U-образной нижней пластине. Закройте эту пластину для разбавления и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день удалите среду из 96-луночного планшета с клетками BV-2. Промойте ячейки в каждой лунке 100 микролитрами комнатной температуры 1x PBS. Снимите PBS с клеточной пластины BV-2. С помощью многоканальной пипетки перенесите 125 микролитров иммунокомплексов из разбавляющего планшета в каждую лунку 96-луночного клеточного планшета BV-2 и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5%_CO2.

После инкубации удалите иммунокомплексы из клеток и промойте клетки в каждой лунке 100 микролитрами комнатной температуры 1x PBS. После удаления 1x PBS добавьте 50 микролитров 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5%_CO2. После этого добавьте 200 микролитров питательной среды и повторно суспендируйте лунку пипетированием вверх и вниз, чтобы отделить клетки.

Перенесите ячейки на 96-луночный U-образный планшет и центрифугируйте его при 400 умноженных на g в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Поставьте тарелку на лед и удалите среду. Добавьте 150 микролитров ледяного 1x PBS и снова центрифугируйте при 400 г в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Поставьте тарелку на лед и снова вымойте, удалив ранее добавленный 1x PBS и добавив 150 микролитров ледяного PBS на лунку. Снова центрифугируйте в тех же условиях.

Поставьте пластину на лед и промойте ячейки, удалив ранее добавленный PBS, и добавив 150 микролитров буфера FACS на лунку. Снова центрифугируйте при 400 г в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Поместите пластину на лед, удалите ранее добавленный буфер FACS и снова суспендируйте ячейки в 200 микролитрах буфера FACS на лунку. Немедленно приступайте к анализу с помощью FACS, чтобы получить 20 000 событий в затворе живой клетки.