Биофизические Анализы для исследования механических свойств клеточного ядра Interphase: Субстрат приложений Процедить и микроиглы Манипуляция

Общая цель следующих экспериментов — измерить механические свойства интерфейса клеточного ядра и его физическую связь с окружающим цитоскелетом. Это достигается путем приложения механического напряжения к клеткам, высеянным на прозрачную силиконовую мембрану, и визуализации вызванных деформаций ядра. Увеличение ядерных деформаций соответствует снижению жесткости ядра, поскольку изменения в связи между ядром и цитоскелетом также могут влиять на индуцированные деформации ядра.

Передача внутриклеточных сил между цитоскелетом и ядром исследуется путем воздействия локального растяжения на цитоскелет. Затем регистрируется смещение флуоресцентно меченных ядерных и цитоскелетных структур. В результате определяются показатели жесткости клеточных ядер относительно окружающего их цитоскелета.

На основании экспериментов по деформации субстрата анализ манипуляций с помощью микроигл показывает, что нарушение связи между ядром и цитоскелетом приводит к дефектам передачи внутриклеточных сил. Основным преимуществом данных методов перед существующими, такими как аспирация изолированных ядер микропипеткой, является возможность измерения механики ядра в целом живых клеток без нарушения нормальной клеточной архитектуры. Эти методы позволяют понять, как изменения в составе ядерной оболочки могут влиять на механические свойства ядра.

Их также можно применять для изучения роли ядерной механики в контексте таких заболеваний, как нейропатии при LA или рак. Каждое устройство для создания деформации состоит из изготовленной на заказ пластиковой чашки без дна диаметром три дюйма и пластикового уплотнительного кольца для удержания силиконовой мембраны, которая служит субстратом для культуры клеток. Для подготовки устройства зажмите кусок силиконовой мембраны размером четыре на четыре дюйма между уплотнительным кольцом и чашкой, осторожно обрежьте излишки мембраны, промойте устройство деионизированной водой, а затем подвергните его автоклавированию перед нанесением на силиконовую мембрану молекул внеклеточного матрикса; отметьте контрольную точку в нижней центральной части внешней стороны мембраны.

Эта метка поможет идентифицировать одни и те же клетки во время экспериментов по применению одноосного растяжения. Вокруг контрольной точки наклеивают две параллельные полоски скотча, чтобы ограничить формирование мембраны в одном измерении. Для обеспечения оптимального прикрепления клеток покройте силиконовые мембраны фибронектином в концентрации 3 µg/mL или любыми подходящими белками внеклеточного матрикса.

Накройте чашку с фильтром перевернутой 10-сантиметровой полистирольной чашкой и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день промойте мембрану один раз раствором PBS, чтобы удалить избыток белка. Залейте в чашку 10 мл ростовой среды и отставьте в сторону.

После подготовки чашки с покрытой силиконовой мембраной обработайте клетки 0,05% трипсином и высейте адгезивные клетки в чашку в ростовой среде. Данная процедура продемонстрирована на примере эмбриональных клеток мыши.

Фибробласты или мезенхимальные клетки инкубируют в течение 24–48 часов в стандартных условиях культивирования. Инвертированный микроскоп, оснащенный для экспериментов по деформации субстрата, включает устройство для создания растяжения, состоящее из базовой пластины, которая устанавливается на предметный столик микроскопа. Пластина удерживает центральный цилиндрический платин, который служит для приложения нагрузки к центральной части силиконовой мембраны.

Устройство также оснащено подвижной пластиной, которая удерживает чашку для растяжения и может перемещаться вверх и вниз по четырем направляющим штифтам, а также грузом массой пять фунтов для создания нагрузки. Для визуализации ядер инкубируйте клетки в чашке для растяжения с красителем Hoechst в концентрации 1 µg/mL в течение 15 минут при 37 °C. После инкубации аспирируйте среду и замените ее на 15 mL ростовой среды без фенолового красного с добавлением 25 mM HEPES.

Затем вкрутите чашку в держатель и осторожно нанесите смазку по периметру нижней части силиконовой мембраны, чтобы обеспечить скольжение мембраны по центральной платине. Убедитесь, что центральная часть мембраны осталась чистой. Установите базовую пластину на предметный столик микроскопа и аккуратно закрепите держатель для чашки на базовой пластине.

Убедитесь, что в исходном состоянии покоя силиконовая мембрана чашки для растяжения свободно лежит на центральной платформе. Затем сфокусируйтесь на нижней части силиконовой мембраны и найдите центральную черную контрольную точку. Эта точка будет служить отправной точкой для всех этапов получения изображений и поможет найти одни и те же клетки во время и после растяжения.

На этом изображении центральная точка заполняет все поле зрения. Начиная от края точки, отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать клетки и верхнюю часть силиконовой мембраны. Найдите хорошо распластанные клетки с ядрами, расположенными центрально.

Получите изображение с фазовым контрастом, сосредоточив фокус на контуре клетки и силиконовой мембране. Затем получите флуоресцентное изображение окрашивания ядерного крючка, сосредоточив фокус на центральной плоскости ядра. После получения изображений от 5 до 15 клеток вернитесь к центральной точке.

Медленно приложите груз к чашке для растяжения, обеспечивая равномерное приложение деформации в центре чашки. Максимальная приложенная деформация субстрата ограничивается нейлоновыми проставками, расположенными на штифтах вертикального выравнивания; после приложения деформации сфокусируйтесь на нижней части силиконовой мембраны и снова найдите контрольную точку, начав с этой точки.

Снова найдите те же самые клетки и повторно получите фазово-контрастные и флуоресцентные изображения каждого ядра клетки при полном растяжении, стараясь максимально точно совместить фокальные плоскости с исходными изображениями. Этот процесс не должен занимать более 10 минут, чтобы избежать активного ремоделирования и адаптации клетки к необычному субстрату. После получения всех соответствующих изображений верните предметный столик микроскопа в исходное положение.

Осторожно снимите груз с пластины держателя чашки и, если необходимо, дайте силиконовой мембране расслабиться. Аккуратно поднимите фильтрационную чашку до ее исходного положения. Затем настройте фазовый контраст и флуоресценцию.

Изображения клеток после растяжения, полученные аналогично изображениям в процессе растяжения, а также снимки клеток и флуоресцентно меченных ядер до, во время и после приложения нагрузки анализируются для вычисления нормированной деформации ядер. В данной демонстрации для анализа используется специально написанный скрипт MATLAB, однако доступны и другие варианты расчета приложенной деформации субстрата вручную путем сопоставления позиций от трех до шести контрольных точек, расположенных на мембране, между соответствующими изображениями до и после полного растяжения. Затем программа MATLAB вычисляет приложенную деформацию мембраны, сравнивая положения соответствующих контрольных точек на изображениях до растяжения и при полном растяжении.

Также сравнивают положения для определения остаточной деформации между изображениями до и после воздействия нагрузки. Контрольные точки используются одновременно для регистрации пар изображений, что помогает обнаружить поврежденные или отслаивающиеся клетки. Затем с помощью отдельной программы MATLAB вручную выбирают ядра, программа которой рассчитывает ядерную деформацию для каждого отдельного ядра.

Это достигается путем сопоставления размеров ядра на соответствующих флуоресцентных изображениях до и после растяжения или путем сопоставления внутриядерных маркеров для учета небольших вариаций приложенного растяжения мембраны в разных экспериментах. Результаты выражаются в виде нормализованного растяжения ядра. Под этим понимается отношение индуцированного растяжения ядра к приложенному растяжению мембраны, рассчитанное для каждого ядра.

Скрипты MATLAB доступны в лаборатории Lambing по запросу. В качестве заключительного этапа каждое ядро проходит валидацию, и измерения в клетках, которые открепились или были повреждены во время приложения деформации, исключаются. ЭМФ, распределенные по двум отдельным областям на силиконовой мембране, были визуализированы с помощью фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии до, во время и после приложения 20% одноосевой деформации; здесь представлен пример успешного эксперимента с валидными ядрами клеток, которые перенесли приложение деформации без каких-либо повреждений или открепления.

Напротив, представленные здесь клетки сократились или частично отслоились во время приложения деформации и исключены из анализа. Клетка слева имеет признаки повреждения цитоскелета и коллапса ядра, в то время как клетка справа частично отслаивается и сокращается при приложении деформации. Это может свидетельствовать об избыточной деформации.

Здесь представлен анализ нормализованной деформации ядер в панели различных линий клеток meth мышей с дефицитом Lamin AC; клетки эктопически экспрессируют либо пустой вектор, либо Lamin A дикого типа в сравнении с клетками однопометников дикого типа. Потеря экспрессии белков ядерной оболочки Lamin AC приводит к увеличению нормализованной деформации ядра. Это свидетельствует о снижении жесткости ядра, которая может быть частично или полностью восстановлена путем повторного введения Lamin A дикого типа. Чтобы подготовиться к эксперименту по манипуляциям с помощью микроиглы, инкубируйте 35-миллиметровую культуральную чашку с стеклянным дном с низкой концентрацией фибронектина в течение двух часов при 37 °C; после инкубации дважды промойте чашку с помощью HBSS и добавьте в неё 2 мл ростовой среды.

Затем эмбриональные фибробласты мыши обрабатывают 0,05% раствором трипсина и высевают в ростовой среде на стеклянные планшеты, покрытые фибронектином, в 2 мл ростовой среды. Чтобы получить отдельные адгезивные неконфлюэнтные клетки, помещают их обратно в инкубатор на ночь. Для окрашивания клеток в ростовую среду добавляют краситель для митохондрий MitoTracker и краситель для ядер Hoechst. Эту ростовую среду добавляют к клеткам, после чего следует инкубация.

Затем промойте клетки, инкубируя их в сбалансированном солевом растворе Хэнкса в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого добавьте к клеткам для визуализации ростовую среду без фенолового красного с 25 mM HEPES.

Для проведения эксперимента с микроиглами установите предварительно вытянутую микроиглу в микроманипулятор, соединенный с инвертированным микроскопом с цифровой камерой на основе прибора с зарядовой связью. Сфокусируйте микроиглу рядом с отдельной клеткой. Получите одно изображение отдельной клетки до введения микроиглы в цитоскелет.

В режиме фазового контраста получите одно флуоресцентное изображение окрашивания крючков 3 3, 3 4 2 и одно флуоресцентное изображение окрашивания митохондрий с использованием объектива 60 x на инвертированном микроскопе. С помощью микроманипулятора осторожно введите микроиглу в цитоплазму клетки на фиксированном расстоянии от периферии ядра и сделайте одно изображение в фазовом контрасте, одно флуоресцентное изображение окрашивания крючков 3 3, 3 4, 2 и одно флуоресцентное изображение окрашивания митохондрий. Перемещайте микроиглу на определенное расстояние в направлении периферии клетки со скоростью 1 мкм/с, используя микроманипулятор с компьютерным управлением, при автоматическом получении изображений каждые 10 секунд.

По мере перемещения микроиглы на определенное расстояние к периферии клетки микроманипулятор должен управляться с помощью компьютера для обеспечения стабильности микроманипуляций. Завершающим этапом процедуры является получение изображений после извлечения микроиглы; изображения флуоресцентно меченных структур ядра и цитоскелета, полученные до, во время и после манипуляций с микроиглой, анализируют для вычисления смещения небольших внутриклеточных областей. В данной демонстрации для анализа используется специально написанный скрипт MATLAB, однако доступны и другие варианты.

Скрипт MATLAB для измерения смещения, вызванного микроиглой, предоставляется лабораторией Lambing по запросу. Программа MATLAB использует алгоритм нормализованной взаимной корреляции для вычисления сдвига между исходным расположением флуоресцентно-меченых структур и их новым определенным положением. Смещения затем отображаются в виде векторных карт и сохраняются в виде числовых значений.

Следующим шагом является использование полученных карт векторов смещения для определения среднего смещения внутри цитоскелета или ядра с помощью matlab. Сначала выберите три или более точек внутри цитоскелета в месте приложения деформации. На карте векторов смещения вычислите среднее числовое значение, чтобы определить величину деформации цитоскелета вблизи места приложения, возникшую в процессе использования микроиглы.

Затем выберите три или более точек внутри ядра рядом с местом приложения деформации и вычислите среднее значение. Это значение представляет собой величину ядерной деформации вблизи места применения микроиглы. Используя тот же метод, определите ядерную деформацию и деформацию цитоскелета в областях, удаленных от места приложения нагрузки, выбрав соответствующие точки в этих регионах.

Для измерения передачи внутриклеточных сил был проведен анализ с использованием микроиглы. Здесь представлены изображения фазового контраста и флуоресцентные изображения фибробласта, окрашенного синим красителем для ядер и зеленым красителем MIT tracker для митохондрий. Микроигла была введена в цитоскелет на определенном расстоянии от ядра и затем перемещена к периферии клетки.

Смещение митохондрий отслеживали до, во время и после воздействия цитоскелетного напряжения, затем результаты смещения были представлены в виде векторов. Каждый вектор соответствует смещению, рассчитанному как разница между исходным положением и вновь определенной позицией. Области с низкой интенсивностью изображения или недостаточной текстурой были исключены из анализа.

Затем количественно оценивали смещение цитоскелета и ядра в выбранных областях на возрастающем расстоянии от места приложения деформации как для контрольных фибробластов, так и для фибробластов. При сохранном взаимодействии нуклео-цитоскелета силы передаются через всю клетку, что приводит к индуцированной деформации ядра и цитоскелета, которая медленно затухает по мере удаления от места приложения деформации. Напротив, в клетках с нарушенным взаимодействием нуклео-цитоскелета наблюдается локализованное смещение вблизи места приложения и лишь незначительная индуцированная деформация на большем удалении.

Сравнимое воздействие деформации цитоскелета в месте введения микроиглы наблюдается как у контрольных фибробластов, так и у фибробластов с нарушенной связью между ядром и цитоскелетом. Однако индуцированное смещение ядра и цитоскелета в других областях было значительно меньше у фибробластов с нарушенной связью между ядром и цитоскелетом, чем в контрольных клетках. Таким образом, снижение смещения цитоскелета и ядра по мере удаления от места приложения деформации указывает на то, что принудительная передача усилия между цитоскелетом и ядром была нарушена.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять ядерную механику и передачу внутриклеточных сил между ядром и цитоскелетом. Эти методы можно использовать для изучения эффекта мутаций в белках ядерной оболочки или изменений состава ядерной оболочки, происходящих в процессе развития или при раке.