Обнаружение модификации гистонов в листьях растений

Надежный и полезный подход для обнаружения модификации гистонов на конкретных растительных генов описано. Подход сочетает хроматин иммунопреципитации (чип) и в режиме реального времени количественной ПЦР. Она позволяет обнаруживать модификации гистонов на конкретных генов с роли в различных физиологических процессах.

Следующий метод обеспечивает надежное и чувствительное обнаружение специфических модификаций хроматина в выбранных генах растений. Сначала сшивка модифицированных гистонов и ДНК с формальдегидом. Затем экстрагируйте и ультразвуком хроматин для облегчения иммунопреципитации с модификацией специфических антител.

Наконец, проанализируйте реакцию чипа путем связывания комплексов гистоновой ДНК и ген-специфичной количественной ПЦР в реальном времени. У растений этот подход может обеспечить молекулярные идеи, такие как специфические модификации гистонов, связанные с фотосинтезом C 4 в лабиринте и системным иммунитетом у Arabidopsis. Основное преимущество иммунопреципитации хроматина по сравнению с существующими методами, такими как марсианская спектрометрия, заключается в том, что этот метод позволяет обнаруживать модификации гистона на выбранных последовательностях в геноме растений.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что протокол включает в себя несколько шагов, правильное выполнение которых является ключом к успеху процедуры. В этом видео мы используем анализ чипов, чтобы получить представление о дерегуляции экспрессии генов в модельном растении Arabidopsis ANA, демонстрируя процедуру mic yakovich, аспирант Для каждого образца начните с сбора двух граммов листьев arabidopsis и 50-миллилитровой пластиковой трубки. Заполните отметку 40 миллилитров буфером для сшивки и расположите специальную фильтрующую губку прямо над буферной поверхностью, чтобы листья оставались погруженными.

Теперь поместите образцы в влагопоглотитель с вакуумом и отфильтруйте в течение 10 минут. Чтобы остановить реакцию сшивания, добавляют 2,5 миллилитра двух молярных глицинов и перемешивают методом инверсии. Затем снова проникните на пять минут, продолжайте пылесосить, проникайте еще пять минут.

Затем сбросить жидкость во время уборки листьев на сито. Промыв листья дважды одним литром воды в пластиковом стакане, тщательно обсушите листья бумажными полотенцами, соберите листья в свежую пластиковую трубочку и заморозьте в жидком азоте. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до выделения хроматина.

С помощью жидкой азотной охлажденной ступки и пестика измельчить замороженные образцы до мелкого порошка. Переложите порошок в пластиковую тубу объемом 50 миллилитров. Суспендируйте порошок в 30 миллилитрах экстракционного буфера номер один, и инкубируйте в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия на верхнем шейкере.

Пропустите суспензию через четыре слоя зеркальной ткани в свежую пластиковую трубку объемом 50 миллилитров. После центрифугирования выбросьте натин SUP. Затем с помощью кисти повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах экстракционного буфера номер два, затем добавьте еще 950 микролитров экстракционного буфера.

Во-вторых, переложите суспензию в микропробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте в течение 10 минут. Тем временем приготовьте две миллилитровые микропробирки, содержащие 1,5 миллилитра экстракционного буфера. Номер три.

Далее отбросьте надосадочную жидкость, чтобы постепенно суспендировать гранулу в 300 микролитрах экстракционного буфера. Номер три. Для начала добавьте небольшой объем буфера.

Номер три, подвесьте гранулу кистью, а затем добавьте оставшийся буфер. Теперь тщательно выложите образцы поверх подготовленных пробирок 1,5 миллилитров экстракционного буфера. В-третьих, гарантия того, что две фазы не будут смешивать образцы центрифуги в течение одного часа при температуре 16 000 раз G при четырех градусах Цельсия.

Выбросьте супнатин и суспендируйте гранулу хроматина малярной кистью в 300 микролитрах ультразвукового буфера звукового хроматина до размера ДНК примерно 400 пар оснований. При ультразвуковой обработке убедитесь, что хроматин не будет нагреваться выше примерно 30 градусов по Цельсию. Для защиты термочувствительных поперечных связей центрифугируйте образец ультразвука для осаждения нерастворенного материала и собирайте надосадочную жидкость в двух миллилитровых микропробирках, содержащих белокагарозу и буфер, связывающий антитела.

Добавьте 200 микролитров образца препарата хроматина. Инкубируйте пробирки в течение одного часа на верхнем шейкере. После центрифугирования соберите пробу надосадочной жидкости и аликвотируйте 30 микролитров белка.

А. А. А. А. к свежим пробиркам объемом 1,5 мл для определения концентрации хроматина в исходном материале. Резервируйте 40 микролитров обработанного ультразвуком хроматина. Затем добавьте 400 микролитров ультразвуковой суспензии хроматина к 30 микролитрам белка aros и соответствующее количество модифицированного специфического антитела инкубируйте в течение ночи в верхнем вибростенде при температуре четыре градуса Цельсия.

Соберите шарики в течение двух минут при 440 градусах G. Удалите надосадочную жидкость и выполните последовательные 10-минутные промывки гранул шариков с 900 микролитрами соответствующего буфера на верхнем встряхивателе. После окончательной промывки полностью удалите остатки буфера. Чтобы освободить ДНК от гистонов, добавьте 400 микролитров буфера для поперечной сшивки D к гранулам и 40 микролитров входного образца, сохраненного ранее в течение пяти минут в центрифуге, и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи.

Теперь очистите ДНК с помощью коммерческого набора для очистки ДНК и выполните обычный локус-специфичный количественный R-T-P-C-R в режиме реального времени. В этом примере экспрессия защитного гена Arabidopsis ANA PR two была индуцирована бензодиасом оле, синтетическим аналогом растительного гормона салициловой кислоты. Результаты показывают, что активация экспрессии PR two связана с увеличением ацетилирования остатков лизина на гистонах H 3 и H 4 на промоторе PR two.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что добавление экстракционного буфера 1 к порошку листьев вызывает избыточное давление в закрытой пробирке fcon. Не забывайте время от времени открывать трубку. Также помните, что нельзя удалять кисть после суспензии гранул перед добавлением следующего буфера.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как определять его модификации и простые рычаги, где образуются альдегидные сшивания ДНК и гистонов, выделение иммунопреципитации хроматина и количественное определение локус-специфической ДНК, чтобы ответить на ключевые вопросы о роли хроматина и его модификаций в различных областях биологии растений.