Снятие отпечатков пальцев ДНК из Микобактерии лепры Штаммы Использование переменных Повторите Тандем номер (VNTR) - Анализ фрагментов Длина (FLA)

Общая цель данной процедуры заключается в разработке дифференцирующего генетического профиля (ДНК-отпечатка) Mycobacterium leprae — некультивируемой бактерии, вызывающей лепру, непосредственно из клинических образцов. Бактериальная ДНК M. leprae, экстрагированная из биопсий пациентов, амплифицируется с помощью мультиплексной ПЦР с использованием флуоресцентных праймеров, специфичных для локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR). После амплификации ДНК проводится капиллярный электрофорез для анализа длины фрагментов.

Данные анализируют для определения количества сегментов коротких тандемных повторов ДНК в каждом локусе. Поскольку различные штаммы EPRI характеризуются разным количеством тандемных повторов в каждом локусе, данные по нескольким локусам позволяют получить уникальные генетические отпечатки ДНК, что дает возможность создать базу данных типов штаммов пациентов с помощью этого метода.

Популяционная структура, эволюция и передача лепры между пациентами в определенных сообществах и по всему миру могут быть охарактеризованы, что в конечном итоге обеспечит генетические инструменты и доказательства для искоренения лепры. Этот метод может быть использован для отслеживания распространения лепры, выявления кластеров недавних инфекций и лиц из группы риска, а также для измерения эффективности контролируемых программ. Процедуру продемонстрируют Ли и Рон Дженсен, исследователи из моей лаборатории, и Джейсон Риверс из нашего центра инструментальных исследований: выделение ДНК из клинических биопсий с использованием стандартного набора для экстракции ДНК KaiGen.

После получения ДНК подготовьте новую рабочую зону внутри чистого бокса для ПЦР. Чтобы избежать контаминации ДНК, протрите бокс и набор дозаторов 70% ethanol, затем подвергните бокс и дозаторы воздействию УФ-излучения в течение 15 минут. После очистки бокса можно приступить к постановке мультиплексной ПЦР; для каждой такой реакции используются от четырех до пяти пар праймеров, где один праймер в каждой паре имеет флуоресцентную метку.

Смеси необходимо подготовить. Используйте стоковые растворы праймеров с концентрацией 10 µM, приготовленные в буфере TE, для создания смесей праймеров. Смешайте равные объемы всех прямых или верхних праймеров в одной пробирке, чтобы достичь конечной концентрации 2 µM. Для каждого праймера при необходимости добавьте буфер TE.

В другой пробирке аналогичным образом смешайте все реверсные или нижние праймеры. После приготовления смесей праймеров подготовьте смесь для ПЦР MES. Составьте карту планшета, указав на ней все образцы и контроли для каждого образца.

Мастер-микс должен содержать 12 µL мультиплексной смеси для ПЦР KaiGen, по два µL каждого пула праймеров и два µL раствора Q. Убедитесь, что приготовлено достаточное количество мастер-микса, чтобы включить контроли и учесть потери при пипетировании. Кратковременно центрифугируйте мастер-микс.

Затем внесите по 18 µL мастер-микса в каждую лунку планшета для ПЦР. Чтобы избежать контаминации образцов ДНК, смените перчатки, протрите и продезинфицируйте отдельный бокс биологической безопасности. Как и прежде, после дезинфекции вытяжного шкафа перенесите планшет в этот бокс.

Затем добавьте по 2 µL образца ДНК в каждую лунку, содержащую мастер-микс. Обязательно используйте наконечники для дозатора с фильтрами для предотвращения аэрозольного загрязнения, чтобы избежать перекрестной контаминации. Осторожно закройте PCR-планшеты и кратковременно центрифугируйте их для перемешивания содержимого.

Затем поместите планшет для реакции в амплификатор и запустите программу ПЦР для анализа образцов. Для проведения фрагментного анализа (FLA) подготовьте формамидную смесь и мастер-микс, затем в чистую пробирку типа «Эппендорф» добавьте разбавленные продукты ПЦР, смешав 12 мкл раствора формамида и 0,3 мкл стандарта размеров GeneScan 500 cL на каждый исследуемый образец. Внесите по 12,3 мкл этого раствора в каждую лунку оптического планшета на 96 лунок.

По завершении ПЦР планшет центрифугируют. Убедитесь, что положение каждого образца зафиксировано на карте планшета. Затем в отдельный 96-луночный планшет внесите по 59 µL воды, свободной от нуклеаз, в каждую лунку и добавьте по 1 µL каждой ПЦР-реакции в соответствующую лунку, чтобы разбавить амплифицированную ДНК в соотношении 1:60.

После разведения ДНК с помощью многоканального дозатора перенесите один микролит каждого разведенного образца ПЦР в соответствующую лунку планшета, содержащего раствор формамида. По завершении программы образцы можно проверить с помощью стандартного агарозного гель-электрофореза, чтобы подтвердить амплификацию фрагментов ДНК ожидаемого размера. Перед анализом образцы подготавливают к флуоресцентному капиллярному электрофорезу с использованием генетического анализатора FLA: установите септу на планшет и кратковременно центрифугируйте его, чтобы удалить пузырьки воздуха и осадить образец на дно лунки.

Для этого IDE химически денатурирует цепи, поэтому термическая денатурация не требуется. Поместите планшет в лоток для загрузки. Проанализируйте меченый продукт ПЦР с помощью капиллярного электрофореза, например, с использованием генетического анализатора ABBI 3130 xl.

Проанализируйте образцы с использованием капилляра длиной 50 centimeter, заполненного полимером POP-7 в качестве разделяющей среды. ДНК мигрирует к концу капилляра, где лазер и детектор фиксируют флуоресцентные метки; откройте программное обеспечение анализатора для сбора данных. Перед запуском образцов анализатор необходимо откалибровать для детектирования всех используемых красителей, включая стандарт размеров; для данных образцов используется стандарт размеров ABI G5. Образцы вводятся электрокинетически при напряжении 1.6 kilovolts в течение 15 seconds.

Разделите фрагменты, приложив напряжение 15 kilovolts в течение 1800 seconds. Общее время каждого запуска составляет около 45 minutes. После завершения запуска создайте файлы данных для каждого образца.

Программное обеспечение анализатора для сбора данных помещает файлы в папку планшета в заранее определенном месте. Файлы представлены в формате FSA. Данные FLA могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения peak scanner, которое бесплатно доступно на веб-сайте Applied Biosystems.

Для анализа данных нажмите «start new project», затем «add files». Загрузите в программу выбранные файлы данных, включая положительный и отрицательный контроли. Выберите загруженные файлы и проведите их анализ.

Результаты представлены в виде хроматограммы FLA. Стандарты размера отображаются в виде оранжевых пиков, в то время как цветные пики представляют бактериальную ДНК-пробы для каждого исследуемого локуса в образце; нажмите на пик, чтобы определить его размер в парах оснований. Из-за проскальзывания нити при синтезе ДНК-полимеразой для некоторых микросателлитных локусов будет обнаружена группа пиков одного цвета.

В таких случаях обычно выбирают пик с наибольшей амплитудой. Сравните размеры фрагментов в каждом образце с размером положительного контроля, чтобы определить количество сегментов тандемных повторов для каждого исследуемого аллеля, и запишите данные в таблицу Excel для дальнейшего анализа. На этом рисунке представлены ДНК-отпечатки изолятов от семи пациентов из трех разных семей из одного села, а также указано количество тандемных повторов для каждого проанализированного полиморфного локуса.

Эти данные свидетельствуют о том, что два члена семьи B инфицированы одним и тем же штаммом, в то время как один член семьи инфицирован другим штаммом. Члены семьи C, вероятно, инфицированы одним и тем же штаммом, так же как и члены семьи A. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как регулярно использовать мультиплексную ПЦР и анализ длины фрагментов для получения VNTR-ДНК-отпечатков пациентов с лепрой, обращающихся в клиники.

Это новые молекулярные инструменты, дополняющие традиционный эпидемиологический надзор для контроля заболевания лепры.