SiRNA-опосредованный сайленсинг генов в нервных стволовых клетках

Возьмем малую интерферирующую РНК, или миРНК, тип РНК, участвующий в подавлении экспрессии генов.

Добавьте сферические липидные пузырьки, называемые липосомами.

Липосома инкапсулирует миРНК, защищая ее от деградации.

Добавьте комплексы миРНК-липосома в культуральную лунку, содержащую нейральные стволовые клетки. Держите одного из них в качестве контроля и инкубируйте.

Липосома сливается с клеточной мембраной, высвобождая миРНК.

МиРНК связывается с индуцированным РНК сайленсинговым комплексом, или RISC, при котором удаляется одна нить.

Оставшаяся цепь нацелена на мРНК, отвечающую за дифференцировку клетки, что приводит к ее деградации.

Добавьте в лунки подходящую среду для дифференциации.

В контрольной лунке факторы роста и другие питательные вещества в среде способствуют дифференцировке нейральных стволовых клеток в остеобласты.

Используя подходящие методы окрашивания, окрашивайте остеобласт-специфичные маркеры на клетках и окрашивайте ядро синим флуоресцентным красителем.

Отсутствие остеобласт-специфичных маркеров в генно-молчаливых клетках указывает на их неспособность к дифференцировке.

Чтобы выполнить нокдаун миРНК в O9-1, клетки восстанавливаются и засевают клетки. Разведите липосомы в соответствующем объеме бессывороточной среды. Затем разведите миРНК в бессывороточных средах в соответствии с текстовым протоколом. После этого добавьте разведенную миРНК в разведенные липосомы согласно инструкции производителя. Смешайте раствор с помощью пипетирования и выдержите 5 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте в клетки соответствующий объем миРНК-липидного комплекса. Затем инкубируйте клетки в течение 24 часов в стандартном инкубаторе для клеточных культур. Клетки O9-1 могут дифференцироваться в различные типы клеток при определенных условиях дифференцировки культур. Для дифференцировки клеток O9-1 в остеобласты готовят остеогенные среды для дифференцировки в соответствии с текстовым протоколом. Наконец, определите маркер остеобластов остеокальцин у дифференцированных остеобластов с помощью иммуноокрашивания.