Стволовые стратегии клеточной трансплантации для восстановления когнитивной дисфункции, вызванной черепно Лучевая терапия

Общая цель данного эксперимента заключается в воспроизводимой трансплантации стволовых клеток в гиппокамп. Во-первых, атимические крысы подвергаются стереотаксической лучевой терапии, моделирующей то, что может произойти во время клинического лечения рака мозга. В лаборатории для трансплантации выращиваются человеческие нервные стволовые клетки, обычно требуется 1 миллион клеток.

Через два дня после облучения стволовые клетки медленно вводятся в гиппокамп в определенном месте. В конечном счете, протокол показывает миграцию трансплантированных стволовых клеток по всему гиппокампу. Впервые идея этих методологий пришла мне в голову, когда я начал рассматривать перспективы использования стволовых клеток для обращения вспять ингибирования нейрогенеза. После облучения черепа, как правило, люди, привыкшие к этому методу, будут испытывать трудности, потому что рост стволовых клеток не тривиален и требует ежедневного внимания и ухода в условиях роста без антибиотиков.

Визуальная демонстрация этой процедуры развеет мифы о клиническом процессе, используемом для реконструкции образов для точного облучения небольших, четко определенных объемов мозга. Демонстрировать процедуру облучения будет доктор Данте Рова, клинический профессор моей кафедры. Получение стволовых клеток будет продемонстрировано техниками г-жи Мэри Лэнд и Кэтрин Тран в моей лаборатории, а доктор Муджа, ученый с докторской степенью, продемонстрирует процедуры, необходимые для трансплантации.

Мы используем программное обеспечение для лучевой терапии под визуальным контролем для точного позиционирования животного перед лечением и модулированную лучевую терапию для целенаправленного облучения с минимальным радиационным повреждением других частей мозга. Через 24 часа после МРТ создайте еще один объем изображения поперечного сечения, поместив животное в компьютерный томограф радиационной онкологии. Поместите крысу в то же положение, которое использовалось для МРТ, и настройте компьютерную томографию на сканирование области черепа, чтобы получить данные для планирования КТ-лечения.

Получение 106 КТ-изображений с толщиной изображения 0,8 миллиметра. Затем перенесите данные изображений МРТ и КТ в программное обеспечение для планирования лечения Eclipse. Используйте eclipse для объединения данных МРТ и КТ на основе анатомии кости и сопоставления мягких тканей.

Это переменный по времени шаг и в зависимости от качества изображения, этот процесс может занять от одного до трех часов. После того, как получено удовлетворительное слияние изображений, оконтурьте облучаемые области-мишени, а также прилегающие критические органы. Облучение может быть направлено на весь мозг или ограничено определенными объемными областями, такими как отдельные бегемоты.

Контуры предоставляют не только местоположение этих органов, но и объемную информацию, которая будет иметь решающее значение для корректировки распределения дозы. Для настройки распределения дозы. Введите информацию о целевой дозе, соответствии цели и ограничениях дозы для критических органов в окно оптимизации дозы в eclipse.

После того, как план построен, eclipse предоставляет рассчитанную дозу, наложенную на аксиальные корональные и сагиттальные изображения, а также в формате гистограммы объема дозы. Именно на этом этапе необходимо оценить план, чтобы определить, подходит ли он для реализации или нуждается в улучшении. Чтобы начать процесс облучения, поместите крысу под усыпленным одеялом под бумажное одеяло, чтобы она согрелась.

Через несколько минут поместите крысу на лечебный стол линейного ускорителя лучевой терапии, накрыв одеялом, но с открытым черепом. Обязательно поместите его в то же положение, которое использовалось для создания компьютерной томографии. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения точности доставки дозы.

Затем получите ортогональные рентгеновские изображения крыс под действием седативных препаратов с помощью встроенной системы визуализации в линейном ускорителе лучевой терапии, зарегистрируйте ортогональные рентгеновские изображения на эталонном наборе изображений, предоставленном Eclipse, и приступайте к применению необходимых коррекций положения для правильного выравнивания изображений. Обеспечьте облучение в дозе 10 баллов с помощью шестиполевого плана IMRT для одного гиппокампа и двухдугового плана быстрой дуги для облучения обоих облучения Hippo campi. После завершения лечения снимите повязку с процедурного кабинета и дайте ей восстановиться в отапливаемой клетке.

Чтобы подготовиться к операции, используйте электрические машинки для стрижки, чтобы удалить шерсть с головы крысы под наркозом. Очистите выбритый участок с помощью повторных применений повидон-йода и 70% этанола, работающих в капюшоне с ламинарным потоком. Подготовьте стереотаксические инструменты, микромолярное сверло, стерилизатор с сухим слоем и контроллеры.

Согревайте животное во время операции, положив его на нагретую поверхность. Стерильные перчатки надеваются до и во время операции и опрыскиваются 70% этанолом. Хирургическое оборудование обслуживается в специальном колпаке с ламинарным потоком.

Для поддержания асептических условий накройте животное небольшой хирургической простыней так, чтобы была открыта только голова. Прочно расположите голову животного в стереотаксической раме, вставив ушные планки во внешнюю слуховую ату. Будьте предельно осторожны при втягивании наконечника воздушного стержня в ушной канал

Установите стержень резца, зацепив верхние резцы крысы и отрегулировав высоту планки до стандартной контрольной точки. Затем затяните носовой зажим. Центрируйте положение головы между ушными планками с минимальным боковым смещением для достижения стереотаксического нуля.

После того, как животное окажется в положении, нанесите смазывающую глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание. Нанесите мазь еще раз во время операции. С помощью стерильного скальпеля сделайте двухсантиметровый разрез кожи по средней линии вдоль волосистой части головы.

Очистите область с помощью стерильного ватного аппликатора с ватным наконечником. Далее вставьте рассекающий ретрактор, чтобы удерживать надкостницу открытой. При возникновении кровотечения сильно надавите на эту область.

С помощью аппликатора с ватным наконечником, смоченного в 1% перекиси водорода, удалите мягкие ткани, покрывающие череп, пока не станут видны швы bgma и lambda. Наиболее сложным аспектом стереотаксической хирургии является точное позиционирование головы животного в стереотаксической раме. Чтобы отметить точные стереотаксические координаты на черепе животного, используйте атлас мозга для определения точных стереотаксических координат с использованием B bgma в качестве эталона В этом исследовании трансплантация стволовых клеток проводится в четырех различных местах с использованием следующих стереотаксических координат для обозначения мест на черепе, во-первых, идентификация bgma.

Следующий ноль. Все три координаты на цифровом контроллере дисплея. После обнуления используйте заранее определенные координаты, чтобы найти места трансплантации и сделать отметку с помощью тонкого маркера, прикрепленного к держателю зонда на раме.

С помощью дрели проделайте отверстия диаметром 0,35 миллиметра в черепе в каждом отмеченном месте. Позаботьтесь о том, чтобы не допустить повреждения мембраны Дарема. Если во время сверления произошло кровотечение, сильно надавите с помощью аппликатора с ватным наконечником.

Теперь животное готово к трансплантации. Человеческие нервные стволовые клетки, используемые для трансплантации, должны быть подготовлены заранее и храниться на льду до тех пор, пока они не понадобятся. Когда все будет готово, наполните микрошприц Hamilton 30 калибра пятью микролитрами клеточной суспензией.

Прикрепите заполненный шприц к небольшому держателю зонда на стереотаксической раме. После перемещения в правильное положение осторожно введите кончик иглы в отверстие в черепе, пока он не достигнет поверхности мозга. Обнулите координату DV на контроллере цифрового дисплея, а затем аккуратно введите иглу на нужную глубину.

Удерживайте иглу на месте в течение одной минуты. По истечении этого времени вводите клетки со скоростью 0,25 микролитра в минуту, что в сумме составляет один микролитр. Удерживайте иглу на месте в течение восьми минут перед втягиванием, чтобы предотвратить капиллярный рефлюкс содержимого инъекции обратно через траекторию иглы, медленно втягивайте иглу от места трансплантации со скоростью 0,5 миллиметра в минуту.

Повторите эту процедуру для остальных мест трансплантации. Когда инъекции будут завершены, удалите ретрактор кожи и с помощью тупого пинцета аккуратно натяните кожу на череп. После операции закройте рану с наложением четырех-пяти стерильных нержавеющих зажимов.

Поместите животное в отапливаемую клетку и следите за его восстановлением. Через месяц после трансплантации образцы мозга были разрезаны и окрашены BRDU для обнаружения трансплантированных NSCS и встречного окрашивания гематином. Траектория иглы, представленная здесь красной линией, указывает траекторию инъекции, которая отложила NSCS в месте высвобождения трансплантата, обозначенном как TR, как видно.

Здесь трансплантированный NSCS показал обширную миграцию из областей cossum и CA one в извилину dente и ca three областей гиппокампа. Важно, чтобы полученный набор изображений Mr.I был точно использован для соответствующего набора изображений КТ. Правильное сращивание изображений имеет решающее значение для идентификации и последующей контурной обработки областей гиппокампа до начала процедуры лечения, получения ортогональных рентгеновских изображений, чтобы гарантировать точное положение животного

Отметьте точные координаты Otax и постепенно извлекайте микрошприц после инъекции, чтобы предотвратить рефлюкс жидкости. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о проведении клинически значимой процедуры облучения с использованием животной модели по вашему выбору и о том, как хирургически пересаживать стволовые клетки в определенную область мозга.