Выделение флуоресцентно меченых нейронов из мозга мышей

Возьмем трансгенную кору головного мозга мыши, содержащую флуоресцентные нейроны, экспрессирующие белки.

Закрепите его на держателе для образца.

Установите держатель на вибратомный лоток, содержащий насыщенный кислородом аКСФ, для поддержания физиологического состояния тканей.

Используя заданные параметры, получить корональные срезы.

Поместите срезы в сетчатый держатель, содержащий насыщенный кислородом aCSF и блокаторы активности для их стабилизации.

Обрабатывайте срезы протеазами, чтобы переварить внеклеточный матрикс и разрыхлить клетки.

Промойте с помощью aCSF, чтобы удалить протеазы.

Переложите ломтики на тарелку для культуры с aCSF и сывороткой.

Под флуоресцентным микроскопом препарируйте участки среза, содержащие флуоресцентные нейроны.

Перенесите рассеченные фрагменты в пробирку, содержащую кислотно-мозговую жидкость и сыворотку.

Механически диссоциируйте ткань с образованием одноклеточной суспензии. Перенесите клетки в культуральную тарелку, содержащую ликвор.

Под флуоресцентным микроскопом используйте капиллярную пипетку для сбора флуоресцентных нейронов.

Поместите эти нейроны в культуральную пластину, содержащую aCSF, для дальнейшего анализа.

Препарируйте мозг усыпленной мыши, открыв черепную коробку маленькими ножницами и извлекя свежий мозг с помощью тонких щипцов, не повреждая кору головного мозга. Поместите мозг в охлажденный и насыщенный кислородом аликвор, оставив воздушный камень, прикрепленный к 5% кислорода, сбалансированного по углекислому газу, в течение всего времени секции.

Расположите мозг на вибратомном патроне и разрежьте корональные или сагиттальные срезы толщиной 300 микрон. Соберите столько секций, сколько необходимо, чтобы получить как минимум от 10 до 50 помеченных ячеек. Положите ломтики на держатель для ломтиков с ватной сеткой, помещенный внутрь стакана, чтобы они были погружены в кислород aCSF.

Переместите ломтики в стакан, содержащий aCSF с блокаторами активности, и заблокируйте на 15-20 минут при комнатной температуре, пузыря кислородом с помощью воздушного камня. Переместите ломтики в стакан, содержащий aCSF с раствором протеазы, чтобы выполнить мягкое пищеварение при комнатной температуре. После разложения промойте протеазу, переместив ломтики обратно в стакан, содержащий aCSF с раствором блокатора активности, в течение 5-10 минут при комнатной температуре. Продолжайте пузыриться кислородом.

Далее приготовьте 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую aCSF с 1% FBS при комнатной температуре, и переместите отдельные секции в чашку для микродиссекции. Под эндоскопом флуоресцентной диссекции используйте пару тонких щипцов для микрорассечения областей и слоев интереса, содержащих минимум от 10 до 50 клеток.

С помощью пастеровской пипетки переместите микрорассеченные кусочки в микроцентрифужную пробирку объемом 2 миллилитра, содержащую примерно 0,8 миллилитра 1% FBS в растворе aCSF. Растертую рассеченную ткань в микрофугальной пробирке при комнатной температуре.

Выполните примерно 10 взмахов каждой из обожженных пастеровских пипеток, начиная с самого большого и заканчивая наименьшим выходным диаметром. Диссоциированные клетки высыпаются в 100-миллилитровую чашку Петри, содержащую кислородосодержащие ФКСФ, и подождите от 5 до 7 минут, пока клетки постепенно осядут.

Наблюдайте за сигналами GFP и RFP под микроскопом для вскрытия. Определите мусор, изучив морфологию при яркопольном освещении. После того, как будет определен участок клеток с небольшим количеством мусора, используйте капилляр и присоединенную трубку для выбора клеток, заблокировав конец клапана трубки язычком. Затем расположите капилляр рядом с клетками. Отпустите блок на капилляре и быстро заблокируйте снова, чтобы захватить клетку с помощью капиллярного действия.

Переместите капилляр в 100-миллиметровую чашку Петри со свежим кислородом aCSF и осторожно подуйте в трубку, наблюдая за кончиком капилляра под флуоресцентной оптикой, чтобы распределить клетки в чашку. Повторяйте процедуру сбора до тех пор, пока не будет собрано от 100 до 150 элементов, убедившись, что загрязняющие вещества, такие как мусор, минимальны в светлопольной дифференциально-интерференционной контрастной оптике.