Сообщение Microfabricated-Array-детекторы (ПЗРК): Подход к изолят механических сил

Привет, меня зовут Натан Сния Деки, и со мной сегодня Уэс Лиган, Робби Десаи и Майк Янг. Мы из лаборатории Криса Чена здесь, в Университете Пенсильвании. В этом видео мы представим наш подход к измерению сил притяжения клеток с помощью микромассива столбов.

Силы вытяжения генерируются за счет взаимодействия миозина и актона и играют важную роль в нашей физиологии. Во время развития они позволяют клеткам перемещаться из одного места в другое, чтобы сформировать ранние структуры нашей ткани. И они также помогают в процессе заживления, потому что они необходимы для закрытия ран или миграции и ползания лейкоцитов по нашему телу.

Но, к сожалению, эти же силы могут нанести вред нашему здоровью в случае метастазирования рака или роста сосудов к опухоли. Таким образом, существует очень мало методов, с помощью которых можно измерить эти силы притяжения количественным образом, особенно на микро- и наноуровне отдельных клеток. Большинство распространенных методов изучения клеток in vitro были связаны с чашками со стеклянным дном или полистирольными чашками, но это очень жесткие субстраты, и они не позволяют нам физически измерить силы притяжения и диффамацию, которые вызывает клетка.

И поэтому было очень трудно понять основные механизмы сил тяги без какого-либо физического считывания. И в лаборатории Криса Чена у нас есть техника, которая позволяет нам преодолеть эти ограничения. Наш метод основан на вертикальном массиве гибких консолей, жесткость и масштаб которых таковы, что отдельные ячейки будут распространяться по нескольким кантилеверам и отклонять их в процессе.

Размеры, которые мы используем чаще всего, — это диаметр трех микрон, диаметр цилиндрических столбов, высота 10 микрон с расстоянием от центра до центра девять микрон и прямоугольный массив. Тем не менее, эти размеры могут варьироваться в зависимости от различных клеточных исследований. Мы начинаем с жесткого кремниевого мастера, который вы можете видеть здесь, а затем переводим его в гибкие консоли PDMS, которые мы видим здесь.

Используя этот метод, мы можем измерить прогибы отдельных консолей под микроскопом и сопоставить клеточные силы тяги с величиной и направлением, необходимыми для создания таких прогибов. Мы превратили эти подложки в М-прокладки для микропостматричных детекторов, и в этом видео мы покажем вам, как изготавливать М-прокладки, начиная с силиконового мастера через репликацию PDMS и, наконец, до вычисления модуляции и клеточной сократимости. Здравствуйте, мы в чистой комнате нашей лаборатории.

Это беспыльное и светочувствительное помещение, которое позволяет нам изготовить СУ восемь стоек, которые будут служить в качестве силиконового мастера. Сначала мы начнем с кремниевой пластины, и с ее помощью мы покроем ее фоторезистом SU eight, SU eight имеет отрицательный резист и чувствительна к свету. Итак, когда мы пропускаем свет через эту фотомаску, это заставляет свет формировать микростолбы, а затем формирует трехмерную структуру, которая затем будет восьмью столбами SU, которые мы затем отбрасываем в PDMS.

Итак, после того, как мы закончим всю нашу обработку, пластина будет выглядеть так, где у нас есть микроколонна, микростержневые структуры, уже изготовленные в пластине. Итак, чтобы сделать мастер-пластины, мы сначала начинаем с голой силиконовой пластины, которая очищается озоном в течение семи минут, а также обезвоживаем эту пластину в течение 30 минут при температуре 120 градусов по Цельсию. Мы собираемся закрутить SU eight 2002 на это, чтобы сформировать очень тонкий базовый слой для столбов.

Итак, поскольку мы собираемся вращать SU eight, я надену противогаз, перезарядлю пластину в этот держатель, смахну пыль, которая может там быть, поместим ее на спиннер, мы проверим, чтобы убедиться, что она отцентрирована. А затем мы продолжим заливать SU eight 2002 года поверх этого. А затем мы пойдем дальше и закрутим пластину. Затем кладем их на горячую плиту, мягкую выпечку.

Мы делаем это в течение одной минуты после этого. Затем мы берем его и переносим на горячую плиту с температурой 95 градусов. И делаем это в течение двух минут.

И когда все будет готово, мы возьмем это и приступим к экспонированию затопления в выравнивателе маски. Итак, мы только что раскрутили SU восемь, первый слой SU восемь на этой пластине, и теперь нам нужно затопить всю пластину, чтобы создать первый базовый слой для микро-постов. Таким образом, нам нужно дать этому 70 миллиджоулей воздействия.

Итак, нам нужно измерить фактическую интенсивность света в нашем выравнивателе маски здесь. Итак, загружаем измеритель в груз в выравниватель маски. Затем экспонируем его светом.

Здесь это ультрафиолетовый свет. Загружаем кремниевую пластину на выравниватель маски, помещаем ее в юстировщик маски. И на этот раз у нас нет маски, так что мы можем показать весь фильм.

Давайте поставим затвор и давайте продолжим, увеличим одну минуту экспозиции, и мы продолжим экспонировать. Итак, через минуту система готова, мы можем вынуть пластину. А теперь нам нужно заняться запеканием после выдержки.

Итак, мы только что обнажили эту пластину и теперь собираемся добавить тепло, чтобы вызвать реакцию сшивания для этого первого покрытия SU eight. Итак, мы помещаем его на горячую плиту с температурой 65 градусов на одну минуту, а затем перекладываем на горячую плиту с температурой 95 градусов на две минуты. После двухминутного процесса мы выключаем конфорку и даем пластине остыть до комнатной температуры, что занимает около 30 минут.

Итак, мы наложили второй слой SU eight на эту пластину. И теперь нам нужно на самом деле высветить это через фотомаску. На этот раз мы будем использовать УФ-фильтр, чтобы блокировать глубокий ультрафиолетовый свет.

Это оптическое стекло Hoya, которое вы можете достать, но на этот раз нам нужно снова измерить интенсивность. Итак, мы собираемся использовать наш экспонометр или мы собираемся использовать фильтр сверху, чтобы измерить интенсивность, которая была отфильтрована. А затем мы загрузим маску в выравниватель маски.

Этот переключатель создает вакуум, который удерживает маску на месте. Затем мы поместим его в выравниватель маски. Затем мы поместим фильтр сверху, а затем загрузим туда пластину.

Мы хотим убедиться, что есть хороший контакт, поэтому мы поднимаем его вверх до контакта, а затем начинаем экспозицию. После воздействия мы вынимаем нашу пластину из выравнивателя маски. Так что теперь у нас есть участки, которые были выборочно открыты. Мы отнесем его в духовку, на горячие плиты, чтобы сделать на нем запекание после экспонирования.

Итак, мы только что закончили The po, окончательную выпечку после экспонирования, и теперь мы собираемся разработать эту пластину, чтобы мы могли получить трехмерные структуры. Что мы собираемся сделать, так это промыть это, развить это в P-G-M-E-A, что смоет неэкспонированный SU 8. Итак, мы сначала начинаем с одной чашки P-G-M-E-A и сажаем сюда на две минуты с легким перемешиванием.

Так что я позволю себе это сделать на две минуты. Итак, мы перейдем ко второму блюду P-G-M-E-A. Это удалит насыщенный P-G-M-E-A с SU eight.

Через 10 секунд мы введем его в IPA. Это смывает P-G-M-E-A. Мы помещаем его сюда на 20 секунд, снова с легким взбалтыванием.

И прямо сейчас у нас есть отдельно стоящие стоечные конструкции. Итак, мы поместим это в гексан, который имеет низкое поверхностное натяжение. Мы собираемся промыть в течение пяти секунд в одном, а затем в двух гексанах, а затем мы готовы высушить его феном.

Итак, мы только что разработали пластину, и теперь мы собираемся поместить ее на горячую плиту и медленно увеличивать температуру до одного 50. И что происходит, так это то, что эта более высокая температура еще больше сшивает SU 8, чтобы сделать его более структурно жестким, и мы оставляем его на этой горячей плите на ночь. Таким образом, где-то от 14 до 20 часов, а затем мы выключаем конфорку и даем ей снова остыть до комнатной температуры.

Итак, что нам нужно сделать, так это нарезать эту пластину кубиками до меньшего размера. По сути, мы хотим разрезать эту кремниевую пластину и создать небольшой чип только с этим внутренним узором. И это будет выглядеть примерно так, как эта, где они собираются использовать эпоксидную смолу.

И мы собираемся приклеить этот чип на предметное стекло вот так. И это обеспечивает структурную основу. Так что нарезать пластину кубиками — это своего рода искусство, но что вы можете сделать, так это использовать алмазный писец и начать только с одного края.

И из-за кристаллических плоскостей, вы просто ставите маленькую выемку, которая создала трещину, которую я затем могу постучать этим инструментом, мы можем удалить это, и мы можем сделать больше разрезов здесь, пока не получим маленькую структуру, вот такую. Затем вы быстро помещаете кремниевый чип на стекло и устанавливаете его на место. И вы позволяете этому застыть.

Итак, после того, как вы закончите, у вас будет устройство, похожее на это. Итак, мы установили силиконовый мастер на это стеклянное стекло и теперь собираемся покрыть его слоем, что поможет освободить эту структуру от PDMS в дальнейшем. Итак, мы поместим чип в этот влагопоглотитель, а затем возьмем несколько капель этого трихлоро-силинга, поместим несколько капель в осушитель.

Мы делаем это внутри капота, потому что это побочный продукт соляного газа, который довольно жесткий. Закройте крышку, прикрепите ее к вакууму, а затем мы дадим ей постоять от пылесоса и дадим этому отложению на ночь, чтобы получить красивое покрытие по всей кремниевой пластине. Привет, меня зовут Уэсли Лиган.

Я учусь в аспирантуре в лаборатории Кристофера Чена. На этом этапе Нейт показал вам, как создать силиконовый мастер для наших подложек для ED. Однако, прежде чем мы сможем использовать этот инструмент для измерения сократимости клеток, необходимо сначала воспроизвести жесткие фотоструктуры с помощью эластомерного силиконового полимера.

Наша первая задача — сгенерировать негативный шаблон силиконового мастера, который мы изготовили ранее. Мы делаем это с помощью кремниевого эластомера под названием PDMS или полиметилслоана к нашему полимеру PDMS. Теперь мы добавляем соотношение отвердителя один к 10.

После того, как мы взвесили раствор, необходимо тщательно перемешать полимер PDMS и агент перекрестной утечки. Очевидно, что такое перемешивание приводит к появлению большого количества пузырьков воздуха в нашем решении. Итак, на этом этапе необходимо снять крышку и дегазировать в вакуумной сушке.

После того, как PDMS полностью дегазируется и все пузырьки поднялись на поверхность и лопнули, мы можем извлечь его из вакуумной сушки. Теперь мы можем использовать эту смесь PDMS и сшивающего агента для создания отрицательной формы нашего силиконового мастера. И для этого мы используем форму для пирога и помещаем в ее центр наш установленный силиконовый мастер.

Затем мы осторожно выливаем полимерный раствор DGAs в чашку поверх кремниевой пластины, стараясь предотвратить образование дополнительных пузырьков. Обычно мы стараемся заливать полимер толщиной примерно в четверть дюйма. Можно заметить, что этот процесс неизбежно вносит в смесь несколько пузырьков воздуха.

Итак, теперь мы откладываем эту посуду примерно на 30 минут, чтобы пузырьки поднялись на поверхность и лопнули. Мы видим, что после того, как он постоял, на поверхности PDMS все еще остается несколько пузырьков воздуха. Однако, поскольку они находятся на верхней поверхности, теперь мы можем использовать быстрый выброс азота, чтобы лопнуть все оставшиеся пузырьки.

Для того, чтобы полностью сшить решение PDMS и CROSSLINKER и сгенерировать жесткий негативный шаблон нашего силиконового мастера, мы запекаем его при температуре 110 градусов Цельсия в течение 20 минут. Мы видим, что поверх силиконовой подложки находится тонкий слой PDMS. И прежде чем мы сможем отделить их друг от друга, необходимо сначала срезать этот слой.

Затем мы можем привить этот верхний слой и аккуратно отделить его от силиконовой подложки. На этом этапе мы можем инвертировать и очень медленно отслаивать отрицательную кремниевую подложку, отрицательную подложку PDMS от силиконовой основы. Хорошо, мы делаем это, удерживая один конец вниз и аккуратно снимая подложку PDMS.

Вы можете видеть фронтальное продвижение по мере того, как подложка отслаивается от силиконового мастера. Теперь, когда мы создали отрицательную форму A-P-D-M-S нашего силиконового мастера, мы можем разрезать ее на четыре отдельные негативные формы, чтобы сделать окончательные подложки для прокладок. На этом этапе важно не касаться верхней части негативной подложки щипцами или перчатками, чтобы не повредить поверхность.

Итак, на данный момент мы создали четыре отдельных негативных шаблона из силиконового мастера, состоящих из лунок диаметром три микрона и глубиной девять микрон. Чтобы регенерировать рельефные консольные поверхности, мы можем снова отлить эти негативные формы из PDMS PDM с использованием PDMS. Однако, прежде чем мы это сделаем, необходимо сначала сделать эти негативные формы неадгезивными, покрыв их флюоросом.

Мы делаем это в плазменной камере мощностью в сто ватт на полной мощности в течение одной минуты. После того, как камера откачает отдачу плазмы, это создает поле ионного газа, которое протравливает верхнюю поверхность PDMS и делает ее более адгезией к молекулам фторуглерода Cy Lane. После удаления отрицательных форм из вакуумной сушки вы можете видеть, что здесь у нас остался массив лунок глубиной три микрона на 10 микрон в неадгезивном слое PDMS.

Для того, чтобы регенерировать вертикальные кантилеверы, которые мы используем для подложек MPAD, необходимо снова отбросить их, используя ту же самую смесь PDMS, и это даст нам положительный отдельно стоящий массив эластомерных консолей, которые идентично отражают кремниевый мастер, который мы изготовили ранее. Первым шагом в этой процедуре является перенос наших неадгезивных негативных форм на монтажный приспособление, которое мы сделали из полосок PDMS и предметного стекла для микроскопа. Причина появления такой оснастки станет понятна на следующем этапе.

На этом этапе мы можем нанести небольшую каплю той же смеси PDMS 10 к одному, чтобы сшивающий агент уже дегасировал на верхнюю поверхность каждой из наших негативных форм. Необходимо лишь небольшое количество PDMS, чтобы он не наталкивался на край отрицательных форм. На данный момент.

Чтобы более полно распределить PDMS по верхней поверхности пресс-форм, мы можем захватить одну из них с помощью щипцов, перевернуть ее и привести в контакт с соседней формой, осторожно распределив вокруг PDMS, чтобы полностью покрыть всю подложку. Будьте очень осторожны на этом этапе, чтобы не ввести дополнительные пузырьки в верхнюю часть раствора PDMS, затем повторить с двумя другими лунками, еще двумя формами. Теперь, когда у нас есть более однородное покрытие PDMS по всей верхней поверхности, мы можем поместить эту кондуктор в вакуумную сушку для дальнейшего удаления любых пузырей, которые могут попасть в пленку PDMS поверх наших негативных форм.

Этот процесс обычно занимает около 30 минут. Пока наши отрицательные формы дегазируются, мы можем очистить стеклянные подложки размером 22 на 22 миллиметра, которые станут окончательным местом крепления прокладок. Первым шагом в этом процессе является сдувание любых частиц пыли с помощью сжатого азота.

Мы подвергнем стеклопакеты воздействию газовой плазмы, которая озолит поверхность и сделает ее более адгезией к PMS, которую мы приклеим к ней на следующем этапе. После того, как верхний слой PDMS попал в DGA в течение примерно 30 минут и плазма активирует стеклозащитные стекла, мы можем затем снять наш шаблон и привести верхнюю поверхность стеклянной защитной пленки, которая подвергалась воздействию газовой плазмы, в контакт со слоем PDMS поверх отрицательных форм. Как правило, сначала помогает привести один край стекла в контакт с PDMS, а затем позволить остальной части стекла осесть в SH, чтобы PDMS распространился в виде листа.

Это помогает уменьшить количество пузырьков, попадающих в пленку PDMS. На этом этапе мы можем осторожно надавить щипцами на верхнюю поверхность защитного стекла, чтобы вытолкнуть излишки PDMS, а также прижать защитное стекло к кресту PDMS в центре шаблона. Это предотвратит смещение защитного стекла во время отверждения PDMS.

Повторяем то же самое для других подложек. На этом этапе мы можем перенести весь шаблон в духовку и выпекать при температуре 110 градусов Цельсия в течение 22 часов. Дав всей сборке остыть до комнатной температуры, мы можем затем снять подложку, инвертировать ее и осторожно снять отрицательную форму со стекла

Важно делать это медленно и равномерно, чтобы не раздавить стойки или не оторвать их от стеклянной подложки. Мы видим, что после снятия негативной формы у нас остается множество консолей, которые в точности имитируют Silicon Master, только теперь они сконструированы из гибкого эластомера PDMS. Итак, на этом этапе мы рассказали вам, как мы создаем мастер-кремний для наших подложек Emad.

Затем мы использовали процесс формования реплики для создания точной копии с использованием эластомерного полимера A-P-D-M-S, так что кантилеверы теперь являются гибкими, что позволяет клетке распространяться, сжиматься и отклонять кантилеверы в процессе. На этом этапе наши субстраты готовы к переработке для клеточной культуры. Теперь, когда мы рассмотрели, как изготавливать и воспроизводить пресс-формы для изготовления EDS, мы собираемся сделать еще несколько шагов для того, чтобы сделать EDS функциональной, чтобы мы могли самостоятельно культивировать и впоследствии анализировать силы тяги.

Но прежде чем мы это сделаем, нам нужно сделать три вещи. Нам нужно нанести кончики столбов клеем на клетки. Во-вторых, нам нужно флуоресцентно маркировать PDMS, чтобы помочь в визуализации и анализе постпрогибов.

И, в-третьих, нам нужно сделать боковые стенки стоек, а также основание стоек неадгезивными к ячейкам, чтобы тяговые силы оказывались только на кончики стоек. Итак, мы увидим, как эти шаги выполняются с помощью стратегии на основе микроконтактной печати в следующие минуты. Но сначала, следующим шагом будет очистка избытка P-D-S-P-D-M-S от EDS.

Итак, как я уже упоминал, первым шагом является использование подложки EDS, которую Уэст только что показал вам, как ее генерировать и обрезать. Избыток PDMS, образовавшийся в результате отверждения стеклянной крышки, скользит по негативной форме и с помощью острой обрезки бритвенного лезвия. Избыток PDMS вы делаете с помощью лезвия бритвы, положив лезвие бритвы вертикально вниз на подложку по краю столбов, а затем соскоблив его.

И вы можете использовать один палец, чтобы удерживать защитное стекло на месте, чтобы защитное стекло не двигалось. Итак, в итоге мы получаем подложку M-образной прокладки, очищенную от мусора, и поэтому она легко доступна. Итак, для следующего шага нам нужно установить микроконтакт, распечатать MPA, чтобы сделать кончики столбов клеящими.

Для того, чтобы это сделать, нам сначала нужно сгенерировать штампы, и этот процесс очень прост. Мы просто добавляем PDMS вместо соотношения 10 к одному, соотношение один к 30 к одному. Заливаем в чашку Петри так, чтобы высота ПДМС составляла примерно один сантиметр.

Дайте ему дегазироваться. То есть, дайте пузырькам подняться к верху PDMS и вылечите реакцию сшивания в духовке при 60 градусах в течение одного часа После того, как я вынул блюдо из духовки и дал ему остыть, теперь я готов вырезать штампы. Итак, опять же, тем же самым лезвием бритвы, просто режьте, надавливая вертикально вниз, чтобы войти в PDMS до тех пор, пока вы не соприкоснетесь с дном чашки Петри.

Теперь ориентация штампа — это то, на что мы хотим обратить внимание. Поверхность штампа будет той стороной PDMS, которая была отлита на дне чашки Петри, чтобы она оставалась плоской. Итак, в этом большом квадрате PDMS, который я вырезал, поверхность штампа теперь обращена лицевой стороной вверх.

Теперь этот штамп намного больше, чем подушечки М, поэтому я собираюсь снова обрезать его до размера одной подушечки М, разрезая лезвием бритвы, потому что очень трудно определить правильную ориентацию штампа на глаз, я собираюсь сделать небольшую выемку на обратной стороне штампа, которая является стороной без лицевой стороны, вот так. И затем я могу удалить штамп с большой плиты. И теперь у меня есть штамп A-P-D-M-S для следующего шага.

Мы хотим очистить штампы PDMS. Так как вполне возможно, что пыль из атмосферы осела на штампы PDMS во время моей резки. Это процесс, при котором мы помещаем желаемое количество штампов PDMS в эту чашку для кристаллизации и заполняем чашку для кристаллизации 100% этанолом.

Так что просто добавьте столько этанола, чтобы покрыть лицевую сторону марок, но точное количество добавленного этанола не важно. А затем поместите кристаллизационный диск в атор и обрабатывайте штампы ультразвуком в течение пяти минут. По истечении пяти минут мы закончим стерилизацию марок и выполним оставшуюся часть микроконтактной печати, которая представляет собой функционализацию М-подушечек в стерильном культуральном колпаке.

Итак, теперь мы находимся в колпаке для культивирования тканей, где мы можем закончить стерилизацию штампов. Для этого мы берем штампы из чашки для кристаллизации, опускаем их в чашку с этанолом, чтобы смыть остатки мусора, и, наконец, опускаем их в чашку с водой, чтобы смыть этанол. Затем струей азота высушиваем штампы до тех пор, пока не останутся видимые капли.

Итак, следующим шагом мы должны нанести на штампы чернила белковым раствором. Белковый раствор, который мы используем, составляет 50 микрограммов на милл фибрина в воде DEI. Просто наберите немного белкового раствора в пипетке и нанесите капли белкового раствора на лицевую сторону штампа.

Вы хотите сделать это, поместив маленькие капельки на край лицевой стороны штампа. Во-первых, повторите это для всех марок, которые вы будете использовать, и я должен был сделать это заранее. Итак, следующим шагом после того, как вы разместили точки по краям всех штампов, будет соединение этих капель и заполнение белкового раствора на лицевой стороне штампа.

Причина, по которой мы это сделали, заключается в том, что белковый раствор в каплях и sos под каплями делает поверхность штампа гидрофилизированной, облегчая распространение белка внеклеточного матрикса. Итак, опять же, повторите это для всех штампов, которые вы используете, теперь, когда мы распределили белковый раствор по лицевой стороне штампов, последний шаг в нанесении красок на штампы - убедиться, что края закрыты. Для этого мы просто наклоняем пипетку под углом и проводим ею по лицевой стороне штампа так, чтобы вы соприкасались как с уголком штампа PDMS, так и с белковым раствором.

И опять же, повторите это для всех краев всех штампов, которые вы рисуете. Теперь, когда мы закончили нанесение штампов, установили эти штампы, мы оставляем штампы в капюшоне для культуры тканей на один час, чтобы способствовать полному впитыванию белка на лицевую сторону штампа. Итак, теперь, когда мы подождали целый час, пока белки не впитаются на поверхность штампа, пришло время промыть их водой и высушить феном с азотом.

Для этого берем стерильную воду и выливаем стерильную воду в посуду, содержащую штампы. Будьте осторожны, чтобы не вылить воду непосредственно на лицевую поверхность штампа, и при необходимости вы можете использовать пипетку. Точное количество воды, которое вы выпили, не имеет значения, если вы доводите уровень воды выше белкового раствора.

После этого стерильным пинцетом возьмите одну марку, опустите ее в новую посуду с водой и аккуратно обдуйте ее азотом. Опять же, вы поймете, что он сухой, когда увидите, когда больше не увидите капель белкового раствора на штампе. И повторите это для всех марок, которые вы обрабатываете по одному.

Итак, теперь, когда мы вымыли штампы насухо, пришло время активировать подложки MPAD, обработав их ультрафиолетовым озоном. На семь минут я снимаю крышку чашки Петри сверху, сверху посуды. Потому что полистирол поглощает ультрафиолетовое излучение, я помещаю блюдо в озонатор для ультрафиолетового излучения, закрываю ящик, устанавливаю время на семь минут и отпускаю.

Итак, теперь мы вернулись в колпак для тканевых культур, и пришло время штамповать субстраты MPAD, которые только что были обработаны УФ-озоном. Для этого поднимаем наши промытые и высушенные штампы с помощью щипцов. Вы можете держать штампы по бокам, но не прикасайтесь к лицевой стороне штампа.

Вы хотите отрегулировать штамп в щипцах так, чтобы белковая сторона была доступна. Затем вы переворачиваете щипцы, помня о том, что белковая сторона находится внизу, и медленно вводите штамп в контакт с эдами. Штампы от одного до 30 довольно липкие, поэтому вам, возможно, придется использовать вторую пару пинцетов, чтобы освободить штамп от щипцов.

Вы можете опустить штамп с высоты от двух до восьми миллиметров на эмеды. Затем наклоните чашку с эмедами вверх и аккуратно придавите щипцами для того, чтобы создать контакт между штампом и эмедами. Вы узнаете о контакте одним из двух способов.

Во-первых, нужно посмотреть на поверхность ED через боковую сторону штампа. Это может быть трудно разглядеть на камеру, но на глаз я могу ясно видеть, что штамп соприкасается с поверхностью, глядя на поверхность через боковую сторону штампа. Второй способ обеспечить контакт с p, заключается в том, чтобы вытащить чашку Петри из колпака для культуры тканей с закрытой крышкой и рассмотреть ее под перевернутым микроскопом.

Визуализируя интерференционные картины с помощью микроскопа, вы должны быть в состоянии определить, когда, если и когда штамп находится в контакте с EDS. После того, как вы определили контакт, штамп должен оставаться в контакте с ним в течение нескольких секунд. Так что теперь пришло время снять штамп.

Для этого сложите эды одним пинцетом и одним плавным движением снимите штамп. Обязательно отслеживайте, какие эды вы штамповали и какие штампы у вас уже использовались. И повторите эту процедуру один раз для каждого субстрата, который вы хотите использовать.

Теперь, когда мы штампуем EMPA, следующим шагом будет их стерилизация, а затем инкубация в липофильный краситель, называемый красителем для глаз. Dai — это липофильная молекула, которая флуоресцентно помечена, поэтому она диффундирует в PDMS в течение определенного времени, что позволяет нам визуализировать постотклонения под микроскопом. Итак, что я собираюсь сделать, так это взять каждый отдельный субстрат empa по одному и погрузить его в 100% этанол, 70% этанол DI вода DI вода DI вода.

И, наконец, пять микрограммов на мил раствор dii. Раствор DII является флуоресцентным, поэтому, чтобы свести к минимуму воздействие окружающего света и свести к минимуму фотообесцвечивание, мы накрываем посуду алюминиевой фольгой, пока она инкубируется в вытяжке для культуры тканей в течение одного часа. Теперь, когда мы подождали один час, пока электромагнитные прокладки инкубируются в растворе DAI, мы можем удалить алюминиевую фольгу и промыть раствор DAI.

Мы промываем его, делая три последовательных погружения в стерилизованную воду и, наконец, погружаем в раствор 0,2% F1 27. Это 0,2% от веса на объем Во время всех этапов погружения важно свести к минимуму время, в течение которого электромагнитные прокладки подвергаются воздействию воздуха. Это необходимо для предотвращения повреждения подложек из ED и, в частности, для предотвращения обрушения двух стоек друг на друга.

0,2%onic F1 27 представляет собой триблок-сополимер, состоящий из гидрофильных и гидрофобных доменов. Известно, что гидрофильный домен сопротивляется поглощению белка и, следовательно, клеточной адгезии, в то время как гидрофобный домен связывается с темпераментом с гидрофобным PDMS. Таким образом, когда PDMS пропитывается F1 27, F1 27 связывается с PDMS и отталкивает клеточную адгезию.

После одного часа инкубации в хроническом F1 27 в чашке Петри, покрытой алюминиевой фольгой, мы можем промыть F1 27 путем последовательного погружения в стерильную воду, стерильную воду и PBS. После погружения в PBS и промывки продукта F1 27 мы можем погрузить субстраты eds в раствор для клеточной культуры по вашему выбору. Раствор для клеточной культуры, в который я только что погрузил EMPA, может содержать сыворотку и/или другие факторы роста и/или добавки, такие как пенициллин и стрептомицин.

Все эти ингредиенты полностью совместимы с процедурами EMPA. Теперь следующим шагом, после того как ЭД были погружены в раствор для клеточной культуры, является посев выбранных клеток в ЭД. Для этой конкретной экспериментальной установки я буду засеивать эндотелиальные клетки легочной аорты крупного рогатого скота в три разные чашки.

Причина, по которой я использую три разные чашки, заключается в том, что я буду обрабатывать две чашки известными ингибиторами тактильной активности, чтобы подавить отклонения стоек, которые мы сможем проверить позже. Итак, чтобы засеять клетки, я просто беру клеточную суспензию, набираю соответствующее количество в пипетку и капляю пипетку в каждую чашку. Я добавляю достаточное количество клеток, чтобы при проведении анализа для измерения тяговых сил они существовали как одиночные клетки на ED.

Количество, которое вы добавите, будет зависеть от площади распространения, а также от скорости роста ваших конкретных клеток. Обычно мы засеваем от 1500 до 5000 клеток на квадратный сантиметр субстрата. После того, как вы закончите засеивать клетки или редактировать клеточную суспензию, по капле к культуре осторожно покачивайте культуру вперед и назад несколько раз в ортогональных направлениях, чтобы смешать клеточную суспензию с чашкой для культивирования.

Повторите этот процесс для всех оснований, которые вы используете. Сразу после посева клеток поместите их в инкубатор с температурой 37 градусов при соответствующем уровне углекислого газа для буферизации pH и среды для клеточных культур. Через два часа, примерно через два часа после посева клеток, целесообразно промыть клетки путем переноса субстратов из одной чашки с питательной средой в свежую чашку с той же клеточной питательной средой.

Причина этого полоскания заключается в том, что большинство клеток начнут распространяться и достигнут почти своей окончательной зоны распространения к двум часам. Промывая клетку и субстраты, вы удаляете любые плавающие клетки из среды для культивирования клеток. Таким образом, только клетки, которые прикрепились к EDS и начинают процесс распространения, будут обнаружены в конечной точке анализа на силы вытяжения.

Одним из анализов, который мы можем провести с клетками, которые были культивированы на МПА, является покадровая визуализация для количественного изучения динамики клеточной сократимости. В частности, интересна динамика сократимости клеток в ответ на растворимые факторы. Известно, что растворимые факторы, такие как биологические и синтетические соединения, увеличивают, уменьшают или оказывают неизвестное влияние на клеточную сократимость.

Для этого эксперимента с живыми клетками мы будем использовать этот инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп. На предметном столике для микроскопа у меня есть маленькая коробка инкубатора, подключенная к терморегулятору, чтобы поддерживать температуру на уровне 37 градусов по Цельсию с 5% CO2. Мы будем получать изображения с большим увеличением с помощью объектива APO с 60-кратным увеличением.

Теперь перейдем к подготовке ударной подложки для визуализации. Объектив с 60-кратным увеличением, который мы используем для визуализации, имеет рабочее расстояние 200 микрон, что намного тоньше, чем толщина чашки для культуры тканей, в которую мы засеяли клетки ранее. Поэтому мы не можем, мы не можем визуализировать клетки на имплантатах в чашке для культивирования тканей.

Чтобы обойти эту проблему, мы используем эти посуды со стеклянным дном. Теперь я перенесу субстрат в стеклянную нижнюю чашку вверх ногами так, чтобы ячейки и кончики стоек оказались на границе стеклянной нижней чашки. Поэтому, когда его помещают на микроскоп, рабочее расстояние между клетками и объективом составляет менее 200 микрон.

Теперь мы готовы поместить это на микроскоп для визуализации. Теперь я открою камеру инкубатора с живыми клетками, поместим внутрь образец и закрою крышку камеры инкубатора. На этом этапе я просканирую субстрат на предмет подходящей клетки.

К изображению. Самый эффективный способ сделать это — использовать объектив фазы один с 10-кратным увеличением, который позволит мне увидеть более широкое поле подложки и быстрее найти ячейку. Мой критерий хорошей ячейки — это одна ячейка.

Он не должен касаться соседних клеток, и он также должен быть примерно среднего размера по сравнению со всеми остальными клетками на субстрате, я нашел подходящую клетку для просмотра. Следующее, что я сделаю, это переключу объектив на 60-кратное увеличение, чтобы смотреть на ячейку с большим увеличением. Для этого мы смещаем фокус с цели, чтобы не удариться о сцену во время вращения.

Во время вращения револьверной головки открываем камеру, частично вращаем объектив 60 x 60 x объектив с масляной иммерсионной линзой, поэтому нам нужно нанести каплю иммерсионного масла на объектив. Теперь мы закончим вращение дерна, чтобы привести 60 x в нужное положение. Мы закроем камеру инкубатора и перефокусируем цель, чтобы вернуть камеру в фокус.

После того, как я точно настрою положение и фокус ячейки, я перейду на ПЗС-камеру, чтобы предварительно просмотреть ячейку на экране компьютера, а затем начну покадровую съемку. Для этого эксперимента я буду собирать как фазовые, так и флуоресцентные изображения с интервалом в одну минуту, так что покадровая визуализация уже началась, и я дам ей продержаться 10 минут или 10 кадров, и к этому моменту я добавлю сыворотку, то уже прошло 10 минут. В это время я открою камеру и добавлю сыворотку в чашку, чтобы стимулировать сократительную способность в клетке.

Таймер все еще работает, поэтому мне нужно сделать это быстро. Теперь мы будем продолжать визуализировать клетку в течение 30 минут, чтобы следить за любыми изменениями сократительной способности. После того, как мы закончим покадровую съемку, изображения могут быть секвенированы в показанный фильм. Вот два фильма фазового и флуоресцентного изображений.

Слева находится фазовый фильм в основном прозрачной клетки, обведенной черным цветом. Клетка распределена по кончикам 20 столбов, которые представляют собой круглые структуры, расположенные в прямоугольной решетке. Справа — флуоресцентный фильм той же клетки, но видны только столбы.

Если я воспроизведу эти фильмы, вы увидите, что стойки, прикрепленные к ячейке, изначально слабые, отклоняются и очень мало отклоняются от прямоугольной решетки. Ближе к середине фильма я добавил сыворотку в носитель. Сыворотка стимулирует клетки к повышению сократительной способности.

По мере того, как клетка оказывает большее тяговое усилие на нижележащие стойки, стойки по периметру клетки начинают отклоняться внутрь. В флуоресцентном фильме вы теперь видите, как стойки значительно отклоняются от своих положений в прямоугольной решетке. Как я опишу позже, смещение этих стоек на этих изображениях может быть использовано для анализа сил притяжения этой ячейки.

Ранее мы видели, как мы генерируем субстраты mpad и как мы функционализируем их для культивирования клеток. Теперь вы, наверное, заметили, что я поместил готовые субстраты mpad в три разные чашки для клеточных культур. Клетки росли за ночь, и теперь я собираюсь обработать каждую отдельную чашку для клеточной культуры различным растворимым агентом, который модулирует сократимость известным образом.

Затем мы можем количественно измерить силы притяжения, возникающие после фиксации ячеек в течение 30 минут. После добавления растворимых факторов через 30 минут после добавления ингибиторов сократительной способности, пришло время зафиксировать клетки с помощью параформного альдегида, чтобы зафиксировать текущее состояние сил вытяжения. Для этого важно использовать параформный альдегид, содержащий кальций и магний, а мы используем параформный альдегид в объемном процентном соотношении 3,7%Способ погружения субстратов в параформный альдегид, простите, такой же, как и метод погружения субстратов в этот, в разные РИН при функционализации.

То есть важно не допустить пересыхания оснований, так как это может привести к последующему обрушению. После того, как я перенес субстраты, я даю им инкубироваться в параформном альдегиде в течение 20 минут. По истечении 20 минут мы удаляем субстраты из параформного альдегида, и теперь, когда клетки зафиксированы, мы можем обработать эти образцы для стандартного иммуноокрашивания.

Для этого мы помещаем подложку лицевой стороной вверх на параметр, а пипетку на достаточное количество PBS, чтобы покрыть подложку, и держим ее под PBS. Затем мы трижды промываем субстрат PBS, чтобы удалить любой параформный альдегид, который может остаться в культуре. После трехкратной промывки субстрата PBS мы можем перенести субстрат для последующего иммуноокрашивания.

Мы делаем это, обрабатывая субстрат пинцетом и инвертируя на первом этапе иммуноокрашивания, который является проникающим агентом. В данном случае мы используем 0,2% Triton X в PBS. Тем не менее, пользователь может использовать любой агент изации, наиболее подходящий для его нужд.

Мы повторяем это для всех наших субстратов, и именно так мы обращаемся с субстратами в процессе иммуноокрашивания. После иммуноокрашивания подложки устанавливаются на стандартное предметное стекло размером один дюйм на три дюйма, которое затем может быть обработано на любом эпифлуоресцентном микроскопе, будь то перевернутый или вертикальный. Обрабатывая образцы на конфокальном микроскопе, мы можем сосредоточиться на нижней части стоек, чтобы получить неотклоненное, то есть нулевое положение.

Затем мы можем сфокусироваться на кончиках столбов, сделать еще одно изображение столбов, и, сравнивая верхнее и нижнее изображение, мы можем измерить прогибы столбов и рассчитать силы притяжения ячеек, которые они создали, чтобы произвести такие прогибы. Проделывая этот процесс для множества различных элементов в нескольких различных условиях, мы можем затем сравнить силы тяги, создаваемые в различных условиях. Теперь, когда мы собрали изображения как живых, так и неподвижных клеток, или следующей задачей будет измерить прогиб, измерить силы притяжения в ячейках.

Для этого, для этого, мы написали компьютерную программу на matlab. Это три изображения, которые мы будем использовать в этом анализе. Первое изображение – это фазовое изображение клетки.

Это полезно для определения местоположения ячейки. Второе изображение представляет собой флуоресцентное изображение верхних частей столбов. Мы используем это изображение, чтобы определить положение столбов на их кончике.

Как вы можете видеть, некоторые из этих столбов отклоняются и отклоняются от прямоугольной решетки, в которой расположено большинство столбов, таких как этот столб. И этот пост. Третье изображение, которое мы будем использовать, — это базовое изображение, на котором запечатлено положение столбов в фокальной плоскости, проходящей через их основание.

На этом уровне как отклоняемые, так и неотклоняемые стойки должны находиться в своих исходных положениях, неотклоняемых. На прямоугольной решетке вы можете видеть, что столбы, которые были отклонены на втором изображении у их основания, находятся в своем положении FL. Это изображение используется для определения положения поста, оно находится под отраженным положением.

Далее мы загружаем программу MATLAB, которая предложит нам загрузить эти три изображения. Присвойте файлу имя. Вы видите изображение фазы.

Мы нарисуем рамку вокруг с указанием того, где находится ячейка, чтобы программа знала, какие посты нужно анализировать. Затем программа выполняет интенсивность, пороговое значение и коррекцию обрезанного изображения для определения OID-координат сообщений. Слева находятся изображения постов с верхнего изображения, а справа - изображения тех же постов с базового изображения.

После получения столбов, координат OID, программа затем может определить векторы смещения между наконечником и основанием каждого столба. Эти векторы постсмещения можно преобразовать в векторы силы, умножив их на пружинную постоянную поста. Мы можем анализировать эти клеточные силы несколькими способами, такими как средняя сила на клетку или средняя сила на столб.

Одним из полезных результатов является колчанная диаграмма, с помощью которой мы можем визуализировать пространственное распределение сил. Это ячейка, которую мы только что проанализировали, и вы можете видеть, что я наложил желтые стрелки на столбы, которые коррелируют с величиной силы и указывают на направление силы. Повторяя этот процесс анализа изображений для последовательностей изображений, подобных тем, которые требуются в нашем фильме с интервальной съемкой, мы можем создать временную последовательность.

Вот фильм о клетке, которую мы стимулировали сывороткой. Как видите, как только сыворотка была добавлена, клетка увеличила сократительную способность и еще больше отклонила столбы. Кроме того, мы можем количественно оценить силы для большего числа клеток, которые были подвергнуты различным условиям, а затем зафиксированы с окрашиванием, как показано на этих колчанных графиках, показывающих клетку, обработанную контрольным соединением, в сравнении с клетками, обработанными ингибиторами сократительной способности.

Как сможете. Как вы можете видеть, векторы силы на ячейке в контрольном случае больше, чем больше по длине по величине векторов силы. В двух случаях, когда использовались ингибиторы сократительной способности, мы рассмотрели здесь много материала, чтобы описать путь субстрата от микропроизводства до подготовки образцов, экспериментов и анализа, чтобы продемонстрировать универсальную универсальность этих субстратов.

Мы описали два разных анализа, визуализацию живых клеток и анализ фиксированного образца, и мы провели анализ клеток, полученных из обоих этих анализов, и показали колчанные графики и колчанные фильмы. С помощью этого мощного инструмента можно проводить различные пространственные и временные анализы сократимости клеток. Как вы видели, этот метод опирается на множество различных дисциплин, включая микропроизводство, основы клеточной биологии, науку о поверхности, анализ и обработку изображений и многие другие.

И именно потому, что его метод основан на нескольких различных инженерных методах, такие параметры, как постгеометрия, индуцированные растворимые факторы и методы анализа постпрогибов, могут быть настроены в зависимости от потребностей пользователя. Мы надеемся, что визуальная демонстрация этого метода, которую мы описали в последние 20-30 минут, может быть использована в качестве отправной точки для других, более глубоких анализов регуляции, функциональных последствий и генерации клеточных сил притяжения.