Трансфекции и Nucleofecting человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель данного эксперимента — достичь высокой эффективности трансфекции индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с использованием оптимизированных протоколов трансфекции и ядерного переноса. Это достигается путем предварительного создания бесклеточных культур индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Для трансфекции индуцированные плюрипотентные стволовые клетки высевают на gelt, TRX или matrigel на ночь.

В то время как для нуклеации с помощью трипсина получают небольшие скопления клеток, к выложенным на планшет клеткам добавляют смесь плазмидной ДНК и реагента для трансфекции Gene Juice, после чего планшет центрифугируют и инкубируют при 37 °C. Суспензия индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека подвергается нуклеации в специальном устройстве для нуклеации, затем клетки ресуспендируют в кондиционированной среде и инкубируют при 37 °C. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие эффективную генетическую манипуляцию за счет высокой эффективности трансфекции в ИПСК человека.

Основное преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как ранее описанные электропорационная трансфекция и методы нуклеафекции, заключается в том, что в нашей лаборатории регулярно достигается высокая эффективность трансфекции индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека со стабильными результатами. Наши протоколы также обеспечивают минимальную гибель клеток после генетической модификации. Таким образом, данные протоколы позволяют осуществлять быстрое и масштабное создание трансгенных линий ИПСК человека. Перед адаптацией индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека к беспитательным культурам подготовьте чашки, покрытые Geltrex.

Затем обработайте человеческие IPC, ранее поддерживаемые на фидерных клетках, добавив по 1 мл Accutane в каждую лунку, и инкубируйте при 37 °C в течение одной минуты; когда большинство клеток начнут открепляться, добавьте к клеткам от 10 до 15 стеклянных шариков и осторожно встряхните планшет круговыми движениями. Затем добавьте 2 мл KnockOut DMEM/F12 и аккуратно тритурируйте. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 10 мл.

Центрифугируйте клетки при 800 об/мин в течение трех минут при комнатной температуре. Отсосипируйте супернатант, не затронув осадок человеческих ИПСК. Осторожно встряхните пробирку, чтобы аккуратно диспергировать клеточный осадок.

Риз, суспендируйте осадок человеческих ИПСК в соответствующем объеме среды STEM pro и распределите его по лункам планшета с TRE-покрытием. В зависимости от скорости пролиферации, человеческие ИПСК можно пересевать с соотношением 1:2 или 1:6. Осторожно поместите планшет в инкубатор с содержанием 5% углекислого газа при температуре 37 °C и аккуратно встряхните его, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по лункам.

Подкармливайте клетки ежедневно. Когда клетки достигают 80% слияния, их можно снова пересевать на новый гель. Для достижения оптимальной эффективности трансфекции клетки в лунке, покрытой Rex, при коэффициенте разделения 1:2 в день трансфекции должны иметь слияние примерно 40–50% и быть распределены по лунке, покрытой гелем, в виде небольших колоний.

Для начала данной процедуры подготовьте 100 µL среды для нокаута в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Добавьте 27 µL реагента для трансфекции Gene Juice, тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте 4 мкг плазмидной ДНК.

Выбор плазмиды имеет решающее значение для обеспечения оптимальной эффективности трансфекции. В данной работе используется плазмида с улучшенным зеленым флуоресцентным белком под управлением промотора CAG, который является сильным промотором, транскрипционно активным в IPC человека. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 15 минут.

Через 15 минут добавьте смесь ДНК (gene juice) к клеткам и перемешайте содержимое лунок. Центрифугируйте планшет при 1 200 об/мин в течение пяти минут для улучшения контакта смеси для трансфекции с человеческими IPC в лунках. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи до следующего дня.

В день проведения ядерной трансфекции для контроля эффективности процесса предварительно обработайте человеческие IPCs 10 µM ингибитора ROCK в течение не менее одного часа при 37 °C. Пока человеческие IPS CS проходят предварительную обработку, приготовьте 82 µL раствора ядерного эффектора для человеческих стволовых клеток в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Добавьте 80 µL.

Добавьте добавку один и тщательно перемешайте, дозируя пипеткой. Инкубируйте раствор при 37 °C в течение пяти минут. Подогрейте предварительно приготовленную кондиционированную среду клеток-фидеров и 0,25% трипсин-ЭДТА до 37 °C внутри вытяжного шкафа.

Заранее промаркируйте одну стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Осторожно удалите среду из культуры человеческих иПСК, предназначенных для переноса ядер, и аккуратно промойте клетки фосфатно-солевым буферным раствором. Аспирируйте PBS и добавьте трипсин; инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение трех минут.

Для успешного воздействия на ядра крайне важно не подвергать клетки воздействию трипсина до состояния отдельных клеток. Вместо этого клетки следует тритурировать до образования небольших групп, состоящих из двух-трех клеток. Осторожно ресуспендируйте клетки с помощью наконечника пипетки P 1000, чтобы сформировать небольшие группы по две-три клетки.

Промойте дно лунки путем многократного пипетирования, чтобы убедиться, что все человеческие IPC полностью открепились. Затем перенесите клеточную суспензию в промаркированную коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Далее добавьте девять миллилитров среды для эмбриональных фибробластов мыши.

Для инактивации трипсина центрифугируйте клетки при 800 RPM в течение трех минут. Осторожно аспирируйте супернатант, не повреждая осадок клеток. Ресуспендируйте клетки в 100 µL предварительно подогретого раствора ядерного эффектора стволовых клеток человека.

С помощью наконечника для дозирования 1 мл перенесите клетки в пробирку для нуклеации. Добавьте 4 µg плазмидной ДНК в клеточную суспензию в пробирке, перемешав клетки и ДНК осторожным вращением. Дважды постучите пробиркой по поверхности вытяжного шкафа.

Поместите пробирку в держатель ядерного эффектора устройства для ядерного эффекта. Выберите программу B 0 1 6 для клеток с ядерным эффектом, нажав кнопку x; на дисплее отобразится «Okay». Когда процесс воздействия на ядра будет завершен, что обычно занимает от одной до пяти секунд, используйте пластиковую пастеризационную пипетку, входящую в набор для ядерного эффекта, чтобы извлечь клетки с ядерным эффектом из пробирки. Восстановите клетки, ресуспендировав их в предварительно нагретом CM с ингибитором ROCK в стерильной 1,5 мл центрифужной пробирке; инкубируйте клетки при 37 °C в течение 10 минут.

Через 10 минут с помощью наконечника дозатора на 1 мл перенесите клетки по каплям на фидерные слои. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи до следующего дня. Оцените эффективность трансфекции.

Здесь представлены микрофотографии экспрессирующих EGFP клеток RIV one человеческих иПСК, трансфецированных с помощью GeneJuice на GelRex через 12 часов после трансфекции плазмидной ДНК. Трансфекция человеческих иПСК с использованием GeneJuice и сильного промотора обычно позволяет получить более 60% экспрессирующих EGFP-репортер клеток в анализе транзиентной трансфекции.

Клетки, экспрессирующие EGFP, также могут быть получены путем нуклеофекции, что показано на данных изображениях человеческих IPCs линии RIV 1, высеянных и сформированных на фидерных слоях после нуклеофекции с использованием программы нуклеофекции B 0 1 6 или программы нуклеофекции A 0 2 3. Использование программы B 0 1 6 позволяет получить до 80% EGFP-положительных клеток, в то время как программа A 0 2 3 дала менее 10% EGFP-положительных клеток. Кроме того, могут быть выведены стабильные клоны трансгенных человеческих iPSC, экспрессирующих ген trends.

Здесь представлен пример стабильно экспрессирующих EGFP колоний индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека с повсеместной экспрессией EGFP, полученных с помощью gene juice. Эти клетки сохраняют конститутивную экспрессию EGFP в процессе дифференцировки в эмбриональные тельца. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как осуществлять нуклефекцию и трансфекцию ИПСК человека.

Эффективные генетические манипуляции являются важным инструментом для изучения различных аспектов биологии стволовых клеток и ускорят применение линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в регенеративной медицине.