Плазменные литографии поверхности паттернов для создания сотовых сетей

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании клеточных микросред для изучения биологических вопросов, касающихся поведения отдельных клеток и групп клеток, которое происходит на микро- и наномасштабном уровнях. Это достигается путем первоначального проектирования шаблонов, которые в конечном итоге будут определять расположение клеток. Затем эти проекты переносятся на поверхности в виде паттернов с помощью фотолитографии, что позволяет создавать формы для плазменного экранирования методом мягкой литографии.

Наконец, эти экранирующие формы располагают в чашке Петри в виде треножника, чтобы обеспечить селективное воздействие плазмы на нижележащие поверхности, что позволит создать чувствительный к клеткам химический паттерн на участках под каждой формой. Таким образом можно получить результаты, демонстрирующие зависимость поведения клетки от её микроокружения и взаимодействия с соседними клетками. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы о влиянии микроокружения на поведение клеток, например, о том, как взаимодействия между группами клеток влияют на феномены более высокого порядка.

И каким образом субклеточные наноразмерные сигналы влияют на такие функции, как жизнеспособность, миграция и дифференцировка? Сначала с помощью суперклея прикрепите предметное стекло с паттерном к стопке чистых предметных стекол. Затем сделайте из алюминиевой фольги контейнер, который будет немного больше стопки стекол и достаточно велик, чтобы вместить 30 grams полидиметилсилоксана (PDMS).

Поместите стопку предметных стекол в контейнер, затем залейте их PDMS для создания первичной формы. После этого удалите пузырьки воздуха из PDMS, поместив контейнер в вакуумную камеру. Чтобы разрушить оставшиеся пузырьки в PDMS, несколько раз быстро прижмите и отпустите палец у трубки впускного клапана, чтобы на короткое время допустить попадание воздуха в камеру.

Клапан закрывают на пять минут для непрерывного дегазирования. Затем ПДМС оставляют для отверждения в чистом ламинарном шкафу при комнатной температуре на один-два дня. После отверждения ПДМС отделяют от мастер-формы, в результате чего получается отливочная форма.

Затем тонким слоем залейте в мастер-форму шесть граммов двухкомпонентного эпоксидного состава, который был перемешан в течение одной минуты. Немедленно удалите пузырьки воздуха из эпоксидной смолы, используя несколько циклов дегазации до ее затвердевания. После того как дегазированная эпоксидная смола постоит в покое в течение одного часа, она частично полимеризуется.

Добавьте в форму больше эпоксидной смолы без дегазации, чтобы создать более толстую структуру, с которой будет проще работать на последующих этапах. Затем оставьте эпоксидную смолу для отверждения на один-два дня. После отверждения извлеките эпоксидную форму из мастер-формы из PDMS, а затем обмотайте эпоксидную форму лентой, чтобы создать контейнер.

Затем можно создать рабочую форму, залив PDMS в эпоксидную форму, удалив из PDMS пузырьки воздуха и оставив новую форму для отверждения на один-два дня. После отверждения рабочей формы отделите ее от эпоксидного основания и поместите обе формы в чашки Петри в герметичный пластиковый контейнер внутри ламинарного шкафа для поддержания чистоты. Чтобы подготовить форму для создания поверхностного рисунка, нарежьте рабочую форму на небольшие секции с помощью лезвия бритвы и поместите эти секции в чашку Петри.

Места расположения этих секций формы отмечают на обратной стороне чашки Петри перманентным маркером, обводя контуры зон, в которых находятся секции формы; затем формируют из секций штатив и прижимают его, чтобы обеспечить плотный конформный контакт между рабочей формой и поверхностью чашки Петри. Посмотрите на дно чашки, чтобы подтвердить правильность размещения, что подтверждается наличием зазоров, видимых невооруженным глазом или с помощью небольшой увеличительной лупы. Поместите сборку в плазменную камеру.

Запустите плазменную обработку после завершения подготовки. Извлеките форму и систему грузов, затем поместите чашку Петри в бокс биологической безопасности под УФ-излучение на 10 минут для стерилизации. Храните чашку там до момента посева клеток.

Разбавьте выбранные экспериментальные клетки в стандартной культуральной среде до достижения желаемой степени конфлюэнтности. Поместите чашку Петри с нанесенным рисунком на поверхность и внесите в нее три миллилитра клеточной суспензии. Инкубируйте чашку Петри с рисунком при 37 °C, 5% carbon dioxide и 100% humidity от нескольких часов до нескольких дней, чтобы клетки могли собраться по рисунку, созданному плазменной ячейкой.

Правильность формирования паттерна проверяют с помощью фазово-контрастной микроскопии. При культивировании клеток нейробластомы ежедневно добавляют 10 micromolar ретиноевой кислоты до тех пор, пока не будет наблюдаться дифференцировка клеток в нейроноподобное состояние. Стандартную среду для культивирования клеток заменяют каждые три-четыре дня.

Типичным результатом применения метода плазменной литографии является формирование клеточного паттерна, напоминающего произвольную или природную структуру. Пример этого представлен на данном рисунке, где нейроны, дифференцированные с помощью ретиноевой кислоты, расположены в виде линий. А здесь, на этом рисунке, созданы линии и сети нейронов; кроме нейронов могут быть использованы и другие типы клеток, как показано на следующих двух рисунках: на этом рисунке представлены эндотелиальные клетки пупочной вены человека, а на данном — клетки скелетных мышц C2C12, образующие сетки, как видно здесь.

Такие материалы, как полилизин, также могут быть нанесены в виде паттернов для облегчения прикрепления определенных типов клеток и для других целей. После выполнения данной процедуры можно внедрить дополнительные элементы, такие как микрофлюидика, зондирование клеток или генетическая модификация специфических белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как комбинации стимулов влияют на поведение отдельных клеток и клеток более высокого порядка?