Выделение и культивирование дофаминовых нейронов среднего мозга первичной эмбриональной мыши

Возьмем ткань дна среднего мозга, выделенную из вентральной области среднего мозга эмбрионов мышей.

Ткань богата развивающимися дофаминовыми нейронами, которые высвобождают нейромедиатор дофамин.

Добавьте ферментный раствор для разрушения тканевого матрикса, тем самым разрыхлив клетки.

Добавьте сывороточный раствор, содержащий ДНКазу I, и механически диссоциируйте переваренную ткань с образованием клеточной суспензии. Сывороточные белки ингибируют ферменты, в то время как ДНКаза I разрушает внеклеточную ДНК, высвобождающуюся во время лизиса клеток, предотвращая слипание клеток.

Дайте тканевым остаткам осесть и перенесите взвешенные клетки в свежую пробирку.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клетки в среде дофаминовых нейронов, или DPM.

Возьмите микропланшет, покрытый субстратом для клеточной культуры, в центре лунок, создав микроостровки.

Перенесите клетки в середину микроостровков, чтобы культивировать их с высокой плотностью.

Инкубируют, позволяя клеткам прилипнуть к микроостровкам.

Заполните лунки ДПМ и инкубируйте, способствуя росту дофаминовых нейронов.

Чтобы создать первичные эмбриональные культуры среднего мозга из эмбрионов мышей на 13,5-й день жизни мыши, объедините все собранные дна среднего мозга в одну и ту же 1,5-миллилитровую пробирку и промойте образцы три раза, добавив 500 микролитров HBSS без кальция и магния на одну промывку. После последней промывки замените HBSS на 0,5% трипсин на 30-минутную инкубацию при 37 градусах Цельсия.

В конце инкубации добавьте 500 микролитров свежеприготовленной DNase I в растворе FBS в частично переваренную ткань и используйте пипетку из силиконизированного стекла с отполированным огнем наконечником для растирания ткани. Когда можно наблюдать только крошечные, едва заметные частицы, позвольте этим фрагментам ткани осесть на дно микроцентрифужной пробирки и перенесите надосадочную жидкость в пустую коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 миллилитров.

Добавьте один миллилитр HBSS в пробирку, содержащую ДНКазу I в FBS, и перемешайте несколько раз с помощью пипетирования. Перенесите один миллилитр этого раствора на оставшиеся частички ткани, и снова растирайте образцы. Затем объедините расщепленную клеточную суспензию с пробиркой надосадочной жидкости без переноса оставшихся фрагментов ткани. После повторного растирания образца ткани с оставшейся ДНКазой I в FBS в HBS осадите собранные клетки центрифугированием и аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулу.

Промойте клетки два раза в двух миллилитрах подогретой дофаминовой нейронной среды за одну промывку и повторно суспендируйте клетки в соотношении 3 x 10⁴ клетки на шесть микролитров свежей, теплой среды в микроцентрифужной пробирке. Затем удалите среду из каждого заранее подготовленного микроостровка и перемешайте клетки с помощью щадящего пипетирования, прежде чем с помощью пипетки объемом 10 микролитров добавить шесть микролитров клеток на каждый микроостровок.

Когда все клетки будут добавлены, заполните пустые лунки по краям планшета 150 микролитрами воды или PBS и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на один час. По окончании инкубации добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежей дофаминовой нейронной среды, и верните тарелку в инкубатор.