Подкожного введения мускариновых антагонистов и Triple-Иммуноокрашивание из Лонг Levator Auris мышц у мышей

Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы ввести мускариновые антагонисты в мышцы LAL взрослых мышей и изучить морфологические изменения нервно-мышечных соединений (njs) в ответ на ингибирование мускариновых ацетилхолиновых рецепторов. Сначала мускариновые антагонисты вводят подкожно с заданной частотой и продолжительностью. После эвтаназии обработанные мышцы LAL осторожно выделяют, удаляя всю соединительную ткань.

Затем мышечная ткань подвергается тройному иммуноокрашиванию для визуализации шванновских клеток двигательного нерва и никотиновых ацетилхолиновых рецепторов с использованием стандартных иммуногистохимических методов. Наконец, применяется конфокальная микроскопия для изучения морфологических изменений нервно-мышечных соединений в мышцах, обработанных мускариновыми антагонистами. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие, что морфологическая организация трехкомпонентного нервно-мышечного соединения серьезно нарушается при ингибировании мускариновых ацетилхолиновых рецепторов.

Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как введение фармацевтических препаратов в скелетные мышцы конечностей грызунов (например, в мышцу гастракнемиус или переднюю большеберцовую мышцу), является то, что длинная малоберцовая мышца (LAL) более доступна и относительно тонка. Это позволяет проводить повторные локальные введения препаратов и визуализировать почти все нервно-мышечные соединения (njs) внутри мышцы. На лабораторном столе, предварительно очищенном этанолом, растворите соответствующую дозу антагониста мускариновых ацетилхолиновых рецепторов в стерильном физиологическом растворе в реакционной пробирке объемом 1,5 мл. Наберите 50 µL раствора в инсулиновый шприц объемом 1 см³, используя отдельный шприц для каждой мыши.

Также подготовьте шприцы, содержащие только физиологический раствор, для каждой мыши контрольной группы, сохраняя все шприцы на льду до момента инъекции. Затем подвергните мышей анестезии с помощью смеси кетамина и ксилазина. После надлежащей седации подтвердите глубину анестезии с помощью метода щипка за пальцы лапы, выбрейте шерсть в области от ростральной части головы до затылочной области шеи и удалите остатки шерсти 70% ethanol. Поместите мышь под стереомикроскоп и введите иглу шприца параллельно мышце LAL так, чтобы кончик иглы находился в каудальной части.

Слегка потяните за иглу шприца, чтобы убедиться, что игла введена в вышележащую соединительную ткань и не повреждает непосредственно саму мышцу LAL. Очень медленно начните вводить раствор над правой мышцей LAL, постепенно вытягивая шприц в течение примерно одной минуты. При правильном введении раствор должен образовать в вышележащей коже купол, который сохранится не менее одного часа.

Повторяйте процедуру каждые 12 часов в течение одного-семи дней перед вскрытием мышц. Эвтаназируйте мышь, затем закрепите ее булавками в диссекционном блюде спиной вверх. Сделайте первый разрез только через кожу, используя маленькие пружинные ножницы, вдоль левой LAL от области непосредственно проксимальнее уха до области вокруг левой лопатки. Осторожно удалите кожу в этой области, стараясь не резать слишком близко к правому уху, так как это одна из точек прикрепления правой мышцы LAL.

С помощью маленьких пружинных ножниц найдите жировую прослойку, расположенную по центру на поверхностной стороне головы в месте схождения правой и левой мышц LAL. Выполните разрез на один сантиметр правее жировой ткани, от проксимального края левой мышцы LAL в направлении левого уха до плеча. После выполнения разреза осторожно отодвиньте правую мышцу LAL маленьким пинцетом, чтобы обнажить вентральную сторону мышцы.

Удалите соединительную ткань и фасцию, осторожно приподнимая правую мышцу LAL пинцетом. Сделайте разрез вокруг каудального конца правой LAL у основания уха и продвигайтесь к ростральному концу правого уха. Держите правую LAL в развернутом состоянии.

На этом этапе лучше взять больше ткани, чем рисковать повреждением самого LAL. Если мышца начнет подсыхать, пипеткой нанесите одну порцию XPBS на мышцу.

Поместите препарированную правую LAL в 30-миллиметровую чашку для культивирования в форме сигары, содержащую 1 XPBS, дорсальной стороной вверх. Закрепите четыре угла мышцы маленькими энтомологическими булавками, используя небольшой пинцет и пружинные ножницы. Очистите соединительную ткань с дорсальной поверхности правой мышцы LAL.

Переверните мышцу и закрепите ее булавками снова, чтобы очистить вентральную поверхность. Две или три мышцы можно поместить в одну чашку диаметром 30 миллиметров для тройного иммуноокрашивания после инкубации с первичными антителами в течение ночи.

Промойте мышцы в растворе one XPB 3 раза по 10 минут, затем добавьте коктейль вторичных антител в блокирующем растворе на один час. Инкубируйте мышцы при комнатной температуре в защищенном от света месте для предотвращения фотовыцветания; по истечении одного часа инкубации промойте мышцы в растворе one XPB 3 раза по 10 минут. Оставив мышцы в свежем растворе one XPBS после последнего промывания, под стереомикроскопом удалите остатки соединительной ткани, а затем отсеките латеральные края LAL.

Поместите мышечную ткань на предметное стекло дорсальной стороной вверх. Затем добавьте две или три капли среды для заключения препаратов. Накройте покровными стеклами и зафиксируйте их с помощью прозрачного лака для ногтей.

Берегите предметные стекла от света и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия до начала анализа. Конфокальные изображения с большим увеличением при тройном иммуноокрашивании нервно-мышечного соединения (НМС) мыши демонстрируют его трехчастную организацию. Тонкие терминальные ветви, отходящие от одного аксона, окрашенного NFS V two, плотно окружены телами терминальных шванновских клеток и их отростками, что видно по окрашиванию S 100 на постсинаптической мембране.

В мышечном волокне кластер никотиновых ацетилхолиновых рецепторов расположен точно напротив ветвей терминалей нервов и терминальных шванновских клеток. В LAL-мышце мыши, получавшей плацебо, наблюдаются нейромышечные синапсы (njs), чья трехкомпонентная организация не нарушена и обладает типичными высокодифференцированными разветвлениями нервного терминаля, что подтверждается тройным иммуноокрашиванием. Напротив, структурная и функциональная целостность этой трехкомпонентной организации серьезно нарушается при ежедневном применении four damp.

Ингибитор мускариновых ацетилхолиновых рецепторов, специфичный для определенного подтипа. Здесь четыре дня вызывают селективную элиминацию нервных окончаний из многочисленных НС на всей поверхности мышцы. Кроме того, терминальные шванновские клетки находятся в состоянии аномального покоя, о чем свидетельствует интенсивное окрашивание белком S 100 при отсутствии отростков.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как вводить мускариновые антагонисты в мышцы LAL и проводить тройное иммуноокрашивание мышц для изучения морфологических изменений нейромышечных соединений в ответ на ингибирование этих рецепторов.