Обнаружение физиологических реакций сенсорных нейронов у дрозофил

Приложите к покровному стеколу анестезированную генетически модифицированную Drosophila melanogaster на боку.

Вытяните его передние лапы и закрепите их, чтобы обнажить сегменты предплюсны.

Эти сегменты имеют вкусовые нейроны, экспрессирующие кальциевые индикаторные комплексы, которые флуоресцируют в кальций-связанной форме.

Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг мухи, чтобы удержать раствор.

Дайте мухе восстановиться и наложите буферный солевой раствор на открытые сегменты тарзальных участков, чтобы увлажнить их.

Под конфокальным микроскопом рассмотрите сегменты тарзы и визуализируйте вкусовые нейроны на различной глубине для получения флуоресценции предварительной стимуляции.

Добавьте на сегмент раствор для стимуляции, содержащий липофильные лиганды.

Эти лиганды связываются с рецепторами вкусовых нейронов, инициируя сигнальные пути и запуская открытие кальциевых каналов.

Это позволяет ионам кальция из внеклеточной жидкости проникать в цитоплазму и связываться с кальциевыми индикаторными комплексами, что приводит к флуоресцентному излучению.

При повторном наблюдении увеличение флуоресценции нейронов подтверждает физиологическую реакцию нейронов на лиганд.

Обезболив муху, приложите ее к покровному листу толщиной 0,17 миллиметра, используя очень маленькую каплю прозрачного лака для ногтей. Прикрепите боковую сторону ширинки к предметному стеклу, используя всю каплю. Затем под рассекающим микроскопом с помощью влажной кисти удлините переднюю лапу мухи. Затем с помощью двух очень тонких полосок ленты закрепите первый и пятый сегменты предплюсны на покровном стекло.

Если необходимо визуализировать нейроны в хоботке, то наложите еще одну тонкую полоску ленты на рострум хоботка, чтобы обнажить лабеллум. Теперь сделайте короткую стенку вокруг мухи с помощью ручки PAP. Дайте анестезии истечь в течение получаса, прежде чем проводить измерения. Для этого протокола приготовьте необходимые разведения 1 миллиграмм на миллилитр стокового раствора лиганда с использованием PBST.

Чтобы начать процедуру, наложите 10 микролитров PBST на закрепленные и открытые сегменты предплюсны. Это увлажняет ногу и предотвращает ее смещение из фокуса. Затем сфокусируйтесь на сегментах с помощью оптической системы, которая может получить хороший флуоресцентный сигнал с быстрым временным разрешением, такой как вращающийся дисковый конфокальный микроскоп с камерой sCMOS. Соберите три Z-стека для предварительной стимуляции интересующих нейронов в тарсальном сегменте.

В этом примере изображения захватываются с экспозицией 200 миллисекунд и группированием 2 на 2 по участку размером 6 на 1/2 микрона каждые две секунды. Обязательно оптимизируйте мощность лазера, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание, сохраняя при этом высокое соотношение сигнал/шум. Здесь 491-нанометровый лазер мощностью 100 милливатт работает на 30% пропускания.

Сигнал должен быть обнаружен до стимуляции, но не приближаться к насыщению. Теперь нанесите пипеткой 10 микролитров раствора для стимуляции на интересующий сегмент тарзы. Во время пипетирования будьте очень осторожны, чтобы не прикасаться к ноге или любому телу мухи, иначе лапки сдвинутся с места. Затем немедленно получите первые изображения после стимуляции и продолжайте собирать достаточное количество изображений, чтобы зафиксировать максимальное изменение флуоресценции.