Профилирование напряжения закрытого калия Выражение мРНК канала в Nigral Нейроны использованием Одноклеточный-ПЦР методов

Общая цель данной процедуры заключается в обнаружении матричных РНК в отдельных нейронах. Это достигается путем патч-клампинга и регистрации отдельных нейронов с последующим полным аспирированием цитоплазмы из каждого зарегистрированного нейрона для выделения мРНК. Затем из цитоплазмы синтезируют кДНК и амплифицируют ее методом ПЦР.

В конечном итоге, специфические мРНК рецепторов, ионных каналов и ферментов могут быть обнаружены с помощью стандартной системы гель-визуализации. Меня зовут, я работаю в Центре медицинских наук Университета Теннесси. Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями, так как количество мРНК в одном нейроне крайне мало и они легко теряются.

Начните выполнение данного протокола с нарезки корональных срезов мозга толщиной 300 микрометров, содержащих среднеростральную часть черной субстанции, с помощью вибратома. Мозг можно выделить из крыс линии Sprague Dawley в возрасте от 15 до 40 дней. Процедура нарезки срезов проводится на льду в высокосахарозном растворе для нарезки, насыщенном смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа при pH 7.4; затем инкубируйте срезы в искусственной спинномозговой жидкости, продуваемой смесью 5% углекислого газа и 95% кислорода.

Поддерживайте температуру на уровне 34 °C и выдержите срезы в течение 45 минут. Затем храните срезы мозга при комнатной температуре до начала регистрации. Начните с переноса одного среза мозга в камеру для локальной фиксации потенциала (patch clamp).

Непрерывно перфузировали оксигенированной искусственной спинномозговой жидкостью при 32 °C. Заполните патч-пипетки автоклавированным внутриклеточным раствором, приготовленным на воде, свободной от ДНК и РНК. Опустите заполненную пипетку в ванну.

Убедитесь, что сопротивление составляет от двух до трех МОм. Сначала найдите компактную часть черной субстанции (substantia nigra), ориентируясь по ее характерному анатомическому расположению. Затем, используя оптику Namar и объектив 60 x, выберите крупные клетки в SNC и SNR для регистрации.

Скорее всего, это дофаминергические или ГАМК-ергические нейроны. Используйте стандартную конфигурацию «whole-cell» с гигаомическим плотным соединением (giga tight seal) для проведения записей в режимах фиксации тока (current clamp) и фиксации напряжения (voltage clamp). Данные записи следует проводить, как правило, менее чем за пять минут, чтобы минимизировать деградацию мРНК.

Примерно за одну минуту можно получить электрофизиологические «отпечатки» интересующих нейронов, регистрируя только их мембранные свойства и активность спайков. После получения данных от интересующего нейрона осторожно втяните цитоплазму с помощью вакуумного аспиратора. При этом важно не нарушить плотность контакта (tight seal), иначе.

В патч-пипетку могут попасть частицы внеклеточного детрита, включая мРНК, что приведет к загрязнению содержимого клетки. Вытолкните содержимое клетки в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл, отломив кончик пипетки и приложив легкое положительное давление. По завершении процедуры немедленно поместите пробирку в морозильную камеру при температуре -20 °C, чтобы исключить контаминацию внеклеточным детритом, который может содержать мРНК.

Создайте отрицательный контроль, собрав содержимое патч-пипетки, опущенной в ткань, без использования аспирации. После сбора содержимого от 10–20 нейронов немедленно приступите к реакции обратной транскрипции. Чтобы минимизировать деградацию мРНК, начните с переваривания любой загрязняющей геномной ДНК с помощью ДНКазы в течение пяти минут при 25 °C.

Этот этап имеет решающее значение для снижения количества потенциальных ложноположительных результатов, и его нельзя пропускать. Затем инактивируйте ДНК, добавив 1.2 µL 25 мM EDTA, и инкубируйте образцы при 70 °C в течение пяти минут. Теперь используйте имеющийся в продаже набор для синтеза cDNA, чтобы убедиться, что геномная ДНК была полностью удалена.

Проведите контрольную реакцию для каждого образца без обратной транскриптазы. При этом все остальные компоненты реакции должны оставаться прежними. Храните продукты при температуре -20 °C до их использования для ПЦР.

Праймеры подбирают согласно последовательностям в GenBank; по возможности используют праймеры, перекрывающие границы интронов, чтобы облегчить обнаружение контаминации геномной ДНК. Для проверки эффективности пар праймеров на первом этапе тестируют их на кДНК из всего мозга. ПЦР-амплификацию 5 µL из 30 µL кДНК проводят в течение 35 циклов, используя стандартный протокол термального циклирования.

На втором этапе проведите ПЦР-амплификацию одного микролитра продукта первого этапа ПЦР с использованием тех же праймеров, применив слегка модифицированный профиль термоциклирования. Затем разделите продукты на 2,5% AGROS-геле и визуализируйте их с помощью бромида этидия или GelGreen. В УФ-свете вырежьте положительные полосы ДНК и секвенируйте их, используя коммерчески доступный набор для выделения ДНК.

Было проведено сравнение электрофизиологических характеристик нейронов компактной и ретикулярной частей черной субстанции. ГАМК-эргические нейроны SNR демонстрировали более высокую частоту спонтанных спайков, составлявшую около 10 hertz. При инъекции гиперполяризующего тока базовая длительность спайков составляла около одной миллисекунды.

ГАМКергические нейроны SNR демонстрировали слабый SAG-ответ, что указывает на слабо активированный ток. Напротив, нигро-дофаминергические нейроны проявляли низкочастотные спонтанные спайки с базовой длительностью около трех миллисекунд. Дофаминергические нейроны также показали выраженный SAG в ответ на гиперполяризацию, что указывает на сильную экспрессию тока IH в ГАМКергических нейронах SNR, но не в дофаминергических нейронах.

Методом одноклеточной ОТ-ПЦР была обнаружена мРНК глутаматдекарбоксилазы 1 — ключевого фермента синтеза ГАМК. Напротив, одноклеточная ОТ-ПЦР выявила мРНК тирозингидроксилазы, ключевого фермента синтеза дофамина, в идентифицированных дофаминергических нейронах SNC и SNR, но не в ГАМК-ергических нейронах.

Затем была использована ОТ-ПЦР единичных клеток для профилирования экспрессии субъединиц вольтаж-зависимых каналов KV3, которые определяют свойства вольтаж-зависимых калиевых каналов. В примере с SNR GABA в отдельном нейроне SNR DA были обнаружены мРНК нейрона для KV 3.1, 3.2, 3.3 и 3.4. В объединенных данных были обнаружены KV 3.2, 3.3 и 3.4.

KV 3.1 чаще обнаруживался в ГАМКергических нейронах SNR, чем в дофаминергических нейронах черной субстанции, что указывает на более высокий уровень экспрессии KV 3.1 в быстропроводящих ГАМК-нейронах SNR. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования перчаток и поддержания чистоты инструментов после их подготовки. Этот метод открыл исследователям в области нейробиологии путь к изучению экспрессии и функции рецепторов и ионных каналов в нервной системе.