Профилирование напряжения закрытого калия Выражение мРНК канала в Nigral Нейроны использованием Одноклеточный-ПЦР методов

Общая цель данной процедуры — детектирование матричных РНК в отдельных нейронах. Это достигается путем применения метода патч-клампа и регистрации отдельных нейронов с последующим полным аспирированием цитоплазмы из каждого зарегистрированного нейрона для выделения mRNA и цитоплазмы. Затем синтезируется cDNA, которая амплифицируется с помощью ПЦР.

В конечном итоге специфические мРНК рецепторов, ионных каналов и ферментов могут быть обнаружены с помощью стандартной системы визуализации гелей. Меня зовут [имя], я работаю в Центре медицинских наук Университета Теннесси. Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями, так как количество мРНК в одном нейроне крайне мало, и они легко теряются.

Начните выполнение данного протокола с нарезания на вибратоме корональных срезов мозга толщиной 300 мкм, содержащих среднюю ростральную часть черной субстанции. Мозги можно выделить из крыс линии Sprague-Dawley в возрасте от 15 до 40 дней. Процедура нарезания срезов проводится при температуре льда в высокосахарозовом растворе для нарезания, насыщенном смесью 95% O₂ и 5% CO₂, при pH 7.4; затем инкубируйте срезы в искусственной спинномозговой жидкости, насыщенной смесью 5% CO₂ и 95% O₂.

Поддерживайте температуру на уровне 34 °C и выдержите срезы в течение 45 минут. Затем храните срезы мозга при комнатной температуре до начала регистрации. Начните с переноса одного среза мозга в камеру для регистрации методом патч-клампа.

Обеспечьте непрерывную перфузию оксигенированной искусственной спинномозговой жидкостью при температуре 32 °C. Заполните патч-пипетки автоклавированным внутриклеточным раствором, приготовленным на воде, свободной от ДНК и РНК. Опустите заполненную пипетку в ванночку.

Убедитесь, что сопротивление составляет от двух до трех МОм. Сначала найдите черную субстанцию, ориентируясь по ее характерному анатомическому расположению. Затем, используя оптику Namar и объектив 60x, выберите крупные клетки в SNC и SNR для регистрации.

С высокой степенью уверенности можно предположить, что это дофаминергические или ГАМК-ергические нейроны. Используйте стандартную конфигурацию «whole-cell» с гигаомным сопротивлением плотного контакта для регистрации в режимах фиксации тока и фиксации напряжения. Данные записи следует проводить в течение не более пяти минут, чтобы минимизировать деградацию мРНК.

Примерно за одну минуту можно получить электрофизиологические «отпечатки» интересующих нейронов, зарегистрировав только свойства их мембран и спайкинг. После получения данных от нужного нейрона осторожно аспирируйте цитоплазму с помощью вакуумного отсоса. При этом плотное уплотнение не должно быть нарушено, иначе

Внеклеточный детрит, включая мРНК, может быть втянут в патч-пипетку и загрязнить содержимое клетки. Вытолкните содержимое клетки в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл, отломив кончик пипетки и приложив легкое положительное давление. По завершении немедленно поместите пробирку в морозильник при температуре -20 °C, чтобы исключить контаминацию внеклеточным детритом, который может содержать мРНК.

Создайте отрицательный контроль, собрав содержимое патч-пипетки, опущенной в ткань, без проведения аспирации. После сбора содержимого от 10–20 нейронов немедленно приступите к реакции обратной транскрипции. Чтобы минимизировать деградацию мРНК, начните с расщепления любой contaminating геномной ДНК с помощью DNase I в течение пяти минут при 25 °C.

Этот этап имеет решающее значение для снижения количества потенциальных ложноположительных результатов, поэтому его нельзя пропускать. Затем инактивируйте ДНК, добавив 1.2 µL 25 mM EDTA, и инкубируйте образцы при 70 °C в течение пяти минут. Теперь используйте имеющийся в продаже набор для синтеза кДНК, чтобы убедиться в полном удалении геномной ДНК.

Проведите контрольную реакцию для каждого образца без обратной транскриптазы, оставив все остальные компоненты реакции неизменными. Храните продукты при температуре -20 °C до их использования для проведения ПЦР.

Праймеры подбирали согласно последовательностям в Gen bank; по возможности вводили дополнительные нуклеотиды в 5'-конец праймеров для облегчения обнаружения контаминации геномной ДНК. Для проверки эффективности пар праймеров на первом этапе протестировали их на кДНК из всего мозга. ПЦР-амплификацию 5 µL из 30 µL кДНК проводили в течение 35 циклов, используя стандартный протокол термоциклирования.

Для второго этапа проведите ПЦР-амплификацию одного микролитра продукта ПЦР первого этапа с использованием тех же праймеров, применив слегка модифицированный профиль циклов. Затем разделяйте продукты на 2,5% AGROS-геле и визуализируйте их с помощью бромистого этидия или GelGreen. В ультрафиолетовом свете вырежьте полосы положительной ДНК и секвенируйте их, используя имеющийся в продаже набор для выделения ДНК.

Было проведено сравнение электрофизиологических характеристик нейронов компактной и ретикулярной частей черной субстанции. ГАМК-эргические нейроны SNR демонстрировали более высокую частоту спонтанных спайков — около 10 hertz. При инъекции гиперполяризующего тока базовая длительность спайков составляла около one millisecond.

ГАМКергические нейроны СЧЯ продемонстрировали слабый SAG-ответ, указывающий на наличие слабо активированного тока. Напротив, нигродофаминергические нейроны проявляли низкочастотные спонтанные спайки с базовой длительностью около трех миллисекунд. Дофаминергические нейроны также показали выраженный SAG в ответ на гиперполяризацию, что свидетельствует о сильной экспрессии тока IH в ГАМКергических нейронах СЧЯ, но не в дофаминергических нейронах.

Методом одноклеточной ОТ-ПЦР была обнаружена мРНК глутаматдекарбоксилазы 1 — ключевого фермента синтеза ГАМК. Напротив, одноклеточная ОТ-ПЦР выявила мРНК тирозингидроксилазы, ключевого фермента синтеза дофамина, в идентифицированных дофаминергических нейронах SNC и SNR, но не в ГАМК-ергических нейронах.

Затем использовали ОТ-ПЦР одиночных клеток для анализа экспрессии субъединиц вольтаж-зависимых каналов KV3, которые определяют свойства вольтаж-зависимых калиевых каналов. В примере с SNR gaba мРНК нейронов для KV 3.1, 3.2, 3.3 и 3.4 были обнаружены только в одном примере нейрона S-N-R-D-A. KV 3.2, 3.3 и 3.4 были обнаружены в совокупных данных.

KV 3.1 чаще обнаруживался в ГАМК-ергических нейронах SNR, чем в дофаминергических нейронах черной субстанции, что указывает на более высокий уровень экспрессии KV 3.1 в быстрых ГАМК-нейронах SNR. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использовать перчатки и поддерживать чистоту инструментов после их подготовки. Этот метод открыл исследователям в области нейробиологии путь к изучению экспрессии и функции рецепторов и ионных каналов в нервной системе.