Профилирование напряжения закрытого калия Выражение мРНК канала в Nigral Нейроны использованием Одноклеточный-ПЦР методов

Общая цель этой процедуры — обнаружить матричные РНК в отдельных нейронах. Это достигается путем зажатия пластыря и записи отдельных нейронов, а затем полностью аспирируют цитоплазму из каждого зарегистрированного нейрона из мрРНК и цитоплазмы. CD NA получают и амплифицируют методом ПЦР.

В конечном счете, специфические мРНК для рецепторов, ионных каналов и ферментов могут быть обнаружены с помощью обычной системы визуализации геля. Меня зовут, я работаю в Центре медицинских наук Университета Теннесси. Как правило, люди, которые плохо знакомы с этим методом, будут испытывать трудности, потому что количество МРТ в одном нейроорганизме чрезвычайно мало и его легко потерять.

Начните этот протокол с использования вибратора, чтобы вырезать корональные срезы мозга толщиной 300 микрометров, содержащие среднюю ростральную часть существенного черного яблока. Мозг может быть выделен от 15 до 40 дней у крыс spra dolly. Процедура резки срезов выполняется ледяным в растворе для резки с высоким содержанием сахарозы, насыщенном кислородом 95% кислорода и 5% углекислого газа, и при pH 7,4, инкубируются срезы в искусственной спинномозговой жидкости и пузырчатся с 5% углекислым газом, 95% кислородом.

Поддерживайте температуру на уровне 34 градусов по Цельсию и оставьте ломтики там на 45 минут. Затем держите срезы мозга при комнатной температуре до момента записи. Начните с переноса одного среза мозга в камеру записи с патч-зажимом.

Непрерывно перфузируется насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкостью при температуре 32 градуса Цельсия. Наполните патч-пипетки автоклавным внутриклеточным раствором, приготовленным из воды, не содержащей ДНК и РНК. Опустите заряженную пипетку в ванну.

Убедитесь, что сопротивление находится в диапазоне от двух до трех мегаом. Во-первых, определите местонахождение значительной черной оболочки по ее анатомическому расположению. Затем с помощью намарной оптики и объектива с 60-кратным увеличением выберите большие ячейки в SNC и SNR для записи.

Это могут быть дофаминергические или ГАМКергические нейроны без колебаний. Используйте обычную конфигурацию целой ячейки с гига-плотным уплотнением, чтобы сделать токовый клещи и электрический зажим. Эти записи обычно должны выполняться менее чем за пять минут, чтобы свести к минимуму деградацию мРНК.

Примерно за минуту можно получить электрофизиологические отпечатки пальцев для интересующих нейронов, записывая только их мембранные и спайковые свойства. После получения данных от интересующего вас нейрона используйте мягкое отсасывание рта для аспирации цитоплазмы. Плотная пломба не должна быть нарушена, как это было бы иначе.

Внеклеточный мусор, в том числе мРНК, может всасываться в пипетку пластыря и загрязнять содержимое клетки. Выдавите содержимое клеток в ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитра, сломав наконечник пипетки и приложив легкое положительное давление. Когда закончите, немедленно поместите пробирку в морозильную камеру при отрицательной температуре 20, чтобы исключить загрязнение внеклеточными остатками, которые могут содержать мРНК.

Произведите отрицательный контроль, собрав содержимое пластыря пипеткой, опущенной в ткань без использования какой-либо аспирации. После сбора клеточного содержимого от 10 до 20 нейронов немедленно начинается реакция обратной транскрипции. Чтобы свести к минимуму деградацию мРНК, начните с расщепления любой загрязняющей геномной ДНК с ДНК в течение пяти минут при температуре 25 градусов Цельсия.

Этот шаг имеет решающее значение для снижения потенциальных ложных срабатываний, и его не следует обходить. Затем инактивируйте ДНК с 1,2 микролитрами 25 миллимолярной ЭДТА и инкубируйте образцы при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут. Теперь используйте коммерчески доступный набор для синтеза CD NA, чтобы убедиться, что геномная ДНК была полностью удалена.

Запустите контрольную реакцию каждого образца без обратной транскриптазы. В то время как все остальные компоненты реакции остаются прежними. Храните продукты при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся для ПЦР-дизайна.

Праймеры в соответствии с последовательностями в банке Gen, когда это возможно, проводят Т-интро, охватывающие первичные репарации, чтобы помочь обнаружить загрязнение геномной ДНК. Чтобы проверить эффективность пар праймеров, протестируйте их на CD NA всего мозга для первого этапа. ПЦР амплируйте пять микролитров из 30 микролитров CDNA в течение 35 циклов с использованием стандартного протокола термоциклирования.

Для второго этапа ПЦР амплируют один микролитр продукта ПЦР первого этапа с тем же первичным ремонтом и используют слегка измененный профиль циклирования. Теперь разделите продукты на 2,5%AGROS геле и визуализируйте их с помощью бромида AUM или геля зеленого. Под воздействием ультрафиолетового излучения вырежьте положительные полосы ДНК и секвенируйте их с помощью коммерчески доступного набора для сбора ДНК.

Сравнивались электрофизиологические характеристики нейронов в вещественных nigra, pars, compacta и pars reticulata. ГАМКергические нейроны SNR демонстрировали более высокую частоту, спонтанные всплески на частоте около 10 Гц. Спайки имели базовую продолжительность около одной миллисекунды после инжекции гиперполяризационного тока.

ГАМКергические нейроны SNR демонстрировали слабую реакцию SAG, указывающую на еженедельно активированный ток. Напротив, негритянские дофаминергические нейроны демонстрировали низкочастотные спонтанные всплески с базовой продолжительностью около трех миллисекунд. Дофаминергические нейроны также показали выраженное САГ в ответ на гиперполяризацию, что указывает на сильную экспрессию тока IH в ГАМКергических нейронах SNR, но не в дофаминергических нейронах.

Одиночная клетка R-T-P-C-R обнаружила мРНК для декарбоксилазы глутаминовой кислоты, ключевого фермента в синтезе ГАМК. Напротив, SNC и SNR идентифицированы дофаминергические нейроны, но не в ГАМКергических нейронах. Одноклеточный R-T-P-C-R обнаружил мРНК тирозингидроксилазы, ключевого фермента для синтеза дофамина.

Далее с помощью одиночной ячейки R-T-P-C-R была использована функция профилирования экспрессии активированных напряжением трехканальных субъединиц КВ, которые изменяют свойства потенциал-зависимых калиевых каналов. В примере SNR gaba нейронные мРНК для KV 3.1, 3.2, 3.3 и 3.4 были обнаружены только в примере нейрона S-N-R-D-A. В объединенных данных были обнаружены КВ 3.2, 3.3 и 3.4.

KV 3.1 чаще обнаруживался в ГАМКергических нейронах SNR, чем в дофаминергических нейронах нигро, что указывает на более высокий уровень экспрессии KV 3.1 в быстрых нейронах ГАМК SNR викингов. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать надевать перчатки и держать инструменты в свободе после их разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению экспрессии и функции рецепторов и ионных каналов в нервной системе.