Стимуляция сенсорных нейронов ганглия дорсального корешка с помощью агониста нейропептидных рецепторов

Возьмите многолуночный планшет, содержащий трансфицированные ганглиозные нейроны заднего корешка крысы.

Нейроны тестовой лунки демонстрируют сниженную экспрессию нейропептидных рецепторов, в то время как нейроны контрольной лунки демонстрируют физиологические уровни экспрессии нейропептидных рецепторов.

Замените среду на среду, не содержащую сыворотки, чтобы обеспечить контролируемую среду для точной реакции на стимуляцию.

Добавьте в лунки агонист нейропептидных рецепторов и перемешайте. Инкубируйте тарелку.

В контрольной лунке агонист нейропептидных рецепторов связывается с рецепторами-мишенями, запуская внутриклеточный сигнальный каскад, который высвобождает нейротрансмиттеры.

Однако в тестовых лунках сниженная экспрессия нейропептидных рецепторов ограничивает связывание агонистов, что приводит к снижению высвобождения нейромедиаторов по сравнению с контролем.

После инкубации соберите среду из лунок и центрифугите.

Перенесите надосадочную жидкость в пробирки и используйте подходящий иммуноферментный анализ для измерения уровня нейротрансмиттеров. Контрольный образец демонстрирует более высокое высвобождение нейротрансмиттеров, чем тестовый образец, после стимуляции агонистов нейрорецепторов.

На 6-й день, после осаждения и через 72 часа после трансфекции миРНК, смените питательную среду на 200 микролитров бессывороточной среды. После 30-минутной инкубации добавьте 1 микролитр химического вещества для стимуляции и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. После инкубации в течение необходимого периода времени соберите питательную среду из чашки для культивирования и центрифугируйте при 5000 г в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы удалить любые взвешенные примеси. Соберите надосадочную жидкость из центрифугирования и при необходимости разбавьте фосфатно-солевым раствором.