Мечение заполненных биоцитином интернейронов в срезах гиппокампа крысы для визуализации

Возьмите фиксированные и пермеабилизированные срезы гиппокампа крысы, содержащие заполненные биоцитином интернейроны с инактивированными эндогенными пероксидазами.

Добавьте авидин-биотиновые комплексы (ABC), содержащие пероксидазу хрена (HRP), и инкубируйте, позволяя авидину связываться с биоцитином.

Смойте несвязанную азбуку.

Добавьте смесь хромогенного субстрата и усилителя металлов, затем инкубируйте.

Введите перекись водорода для активации HRP, которая окисляет подложку с образованием темного осадка, в то время как усилитель улучшает контраст.

Переложите срезы на фильтровальную бумагу и удалите излишки буфера. Обработайте тетраоксидом осмия для усиления контраста.

Поместите ломтики на предметное стекло и закрепите. Обезвоживайте их, повышая концентрацию этанола.

Промойте ломтики в абсолютном этаноле и оксиде пропилена.

Добавьте смолу, чтобы проникнуть в ткани.

Поместите ломтики в планшет и нагрейте, чтобы смола полимеризовалась. Переложите ломтики на предметное стекло, установите покровную крышку и затвердейте смолой.

С помощью световой микроскопии визуализируйте темные интернейроны, заполненные биоцитином.

Поместите срезы в чистый стеклянный флакон, содержащий PBS. Проведите реакцию авидина HRP путем предварительной инкубации участков в биотиновом комплексе авидина (ABC) в течение не менее двух часов для амплификации продукта реакции HRP.

Далее промойте срезы PBS 3 раза по 10 минут, а затем с Tris buffer два раза по 10 минут. После удаления последнего следового буфера быстро добавьте 1 каплю 8% раствора хлорида никеля в раствор диаминобензидина или раствор DAB. Затем пипеткой введите и выдохните раствор для перемешивания.

И быстро добавить 1 миллилитр этого раствора по срезам. Инкубируйте секции в этом растворе в течение 15 минут. Затем добавьте в раствор DAB 10 микролитров 1% перекиси водорода. Дайте реакции протекать в темноте при постоянном перемешивании в течение примерно 1-2 минут, пока клетки не будут помечены.

В вытяжной шкаф поместите небольшой круг фильтровальной бумаги в чашку Петри и смочите его PB. Поднимайте секции по одному из стеклянного флакона с помощью кисти и аккуратно кладите их на бумагу. Накройте срезы еще одним смоченным кругом фильтровальной бумаги. И удалите излишки буфера, аккуратно прикоснувшись папиросной бумагой к поверхности.

Нанесите 8 или 9 капель 1% тетраоксида осмия в PB на верхнюю бумагу. Накройте посуду крышкой и оставьте в вытяжном шкафу не менее 30 минут, но не более одного часа. После промывки, монтажа и снятия крышки секций обезвоживайте с помощью серии растворов 50%, 70%, 95% и 100% спирта.

После этапа обезвоживания переложите срезы в стеклянный флакон, содержащий 100% этанол, в шейкере примерно на 5 минут. Замените спиртовой раствор окисью пропилена, и постирайте трижды в течение 5 минут. После последней промывки держите во флаконе около 2 миллилитров оксида пропилена и добавьте смолу в соотношении один к одному.

Следите за тем, чтобы смола растворилась, и держите срезы при постоянном перемешивании в течение 30 минут. Через 30 минут с помощью деревянной палочки поместите каждую секцию в алюминиевую доску, содержащую эпоксидную смолу, и инкубируйте в течение ночи. На следующий день поместите планшет на горячую плиту примерно на 10 минут.

Затем возьмите каждую секцию деревянной палочкой и поставьте на чистую горку. После того, как все срезы будут перенесены на предметное стекло, просмотрите предметное стекло под микроскопом, чтобы проверить ориентацию срезов и наложить на них покровное стекло. Отверждаем в духовке 48 часов при температуре 56 градусов Цельсия.