Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

В этом видео показана процедура разделения смешанных вирусных ассоциаций на основе их нуклеинового кислотного состава. Это позволяет изучать таксономическое разнообразие и функциональный потенциал сложных вирусных сообществ. Здесь гидроксиапатит, кристаллическая форма фосфата кальция, используется для разделения нуклеиновых кислот.

Сначала колонку с гидроксиапатитом упаковывают, а затем на колонку наносят уравновешенные очищенные вирусные нуклеиновые кислоты, зарядовое взаимодействие между положительно заряженными ионами кальция гидроксиапатита и отрицательно заряженным фосфатным остовом подтипов нуклеиновых кислот связывает нуклеиновые кислоты с колонкой Nick. Затем одноцепочечная, D-N-A-R-N-A и двухцепочечная ДНК последовательно упоминаются с различными концентрациями фосфатного буфера. Полученные нуклеиновые кислоты затем обессолены и концентрируются при подготовке к визуализации, количественному определению и идентификации с помощью секвенирования ДНК Гель-электрофорез Agros подтверждает, что виды нуклеиновых кислот могут быть разделены с менее чем 9% переноса.

Таким образом, этот метод позволяет оценить разнообразие и функциональную способность вирусных сообществ. Здравствуйте, меня зовут Дуг Фро, и я научный сотрудник в лаборатории доктора Шеннона Уильямсона в Венчурном институте Крейга. Сегодня я покажу вам процедуру отделения одноцепочечной ДНК, двухцепочечной ДНК и РНК от вирусной группы окружающей среды.

Этот метод имеет преимущества по сравнению с существующими методами, такими как обработка ядром, которое нацелено либо на ДНК, либо на РНК. Гидроксиапатитовая хроматография обладает способностью захватывать все вирусное сообщество. Этот метод позволяет ответить на несколько вопросов в области вирусной экологии.

Например, каков общий набор генов или разнообразие вирусного сообщества? Впервые мы подумали об этом методе, когда хотели изучить все комплексы планктона Рио-де-Жанейро из Чесапикского залива, не жертвуя при этом частью генетической сигнатуры. Растворы, необходимые для этого эксперимента, должны быть приготовлены заранее в соответствии с инструкциями в прилагаемом письменном протоколе и включать 0,12 молярного фосфатного буфера, 0,20 молярного фосфатного буфера, 0,40 молярного фосфатного буфера и один молярный раствор фосфата.

При pH 6,8 и гидратированном гидроксиапатите в день эксперимента уравновесьте все фосфатные буферы и гидратированный гидроксиапатит, поместив их в водяную баню при температуре 60 градусов Цельсия. Начните эту процедуру с подготовки колонки econo, которая будет использоваться для разделения вирусных нуклеиновых кислот. Прикрепите запорный кран к концу колонны эконом и убедитесь, что он закрыт.

С помощью пипетки добавьте в колонку деионизированную воду, затем поместите крышку на верхнюю часть колонки и многократно переверните колонку, чтобы промыть ее. Слейте воду и повторите эту промывку несколько раз. Далее снимите запорный кран с колонки экон и автоклавируйте его для стерилизации.

Запорный кран не является автоклавным, так как он будет плавиться. Промойте стопорный кран ионизированной водой, затем еще раз 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе после автоклавирования. Установите на место стопорный кран и закройте его.

Далее, работая в вытяжном шкафу, добавьте в колонну один миллилитр сигма-слоя и покройте стекло колонны, перевернув колонну вращательным движением, как показано здесь. Покрытие сигма-слоем сведет к минимуму прилипание нуклеиновых кислот к поверхности стекла. Во время разделения на поверхности из одного солевого стекла наносится покрытие.

Откройте запорный кран и сцежьте в коническую трубку. Далее, чтобы подключить колонну к циркуляционной водяной бане, с помощью двух хомутов прикрепите колонну к кольцевой подставке. Прикрепите силиконовую трубку от циркуляционной водяной бани, чтобы поток воды из водяной бани шел снизу вверх.

Установите температуру на 60 градусов по Цельсию и запустите циркуляцию. В то время как на практике колонна и трубки должны быть обернуты изоляционным веществом, таким как алюминиевая фольга или изоляция труб из пенопласта. Чтобы свести к минимуму потери тепла, этот шаг здесь не показан.

Для того чтобы лучше визуализировать процедуру, закройте запорный кран. С помощью пипетки добавьте 10 миллилитров стерильной РНК свободной воды. Откройте запорный кран и дайте воде стечь.

Затем снова промойте после второй стирки. Дважды промойте 10 миллилитров стерильных РНК, не содержащих 0,12 молярфосфатного буфера, и сцедите между стирками. Теперь колонка готова к гидроксиапатитовой хроматографии.

Убедитесь, что стопорный кран колонки econ закрыт. Затем с помощью стерильной двухмиллилитровой серологической пипетки медленно добавьте в нижнюю часть колонки два миллилитра подготовленного ресуспендированного регидратированного гидрокси аппетита. Установите на место колпачок колонны.

Дайте гидроксиаппетиту успокоиться под действием силы тяжести в течение 30 минут. Этот метод требует внимания к деталям. Колонка гидроксиаппетита обрабатывает данные со скоростью от 0,25 до 0,5 мил в минуту.

Поэтому очень важно внимательно следить за колонной, чтобы она не пересыхала. По прошествии 30 минут откройте запорный кран, чтобы слить воду из буфера в контейнер для отходов. Закройте запорный кран и сбросьте сквозной поток.

Соедините нуклеиновые кислоты с 0,12 молярного фосфатного буфера в конечном объеме 500 микролитров и инкубируйте его при температуре 60 градусов Цельсия в течение 10 минут. Это уравновесит нуклеиновые кислоты в соответствии с температурой колонки и усилит разделение различных видов нуклеиновых кислот за счет удаления любых вторичных структур, которые могут присутствовать. С помощью двухмиллилитровой серологической пипетки быстро нанесите раствор нуклеиновой кислоты на гидроксиаппетит, следя за тем, чтобы не потревожить колонку.

После того, как все 500 микролитров потекут на колонку, в верхнюю часть колонки можно добавить небольшое количество 0,12 молярного фосфатного буфера, чтобы предотвратить ее высыхание. Дайте нуклеиновым кислотам соединиться с гидроксиаппетитом в течение 30 минут. После инкубации связывания поместите под колонну коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Затем откройте стопорный кран и соберите первоначальный образец объемом 500 микролитров, который содержит одноцепочечную ДНК. Как только будет собрано 500 микролитров, закройте запорный кран. Затем добавьте шесть миллилитров 0,12 молярного фосфатного буфера в гидроксиаппетит, следя за тем, чтобы не потревожить колонку.

Затем откройте запорный кран и продолжайте собирать поток через содержащую синглетную многоцепочечную ДНК в той же 15-миллилитровой пробирке с предыдущего этапа. После того, как будет собрано примерно шесть миллилитров, закройте запорный кран. Добавьте один объем раствора фенолхлороформа изоамилового спирта в пробирку, энергично перемешанную вортексом, затем центрифугируйте при 3,500 G в течение 15 минут.

После центрифугирования пробирка будет содержать два слоя. Перенесите верхний слой согласия, который содержит одну цепь ДНК, в новую пробирку объемом 15 миллилитров и храните образец при комнатной температуре для элюирования и очистки РНК. Из колонки добавьте шесть миллилитров 0,20 молярного фосфатного буфера и соберите проточные отверстия перед использованием новой 15-миллилитровой пробирки. Затем проведите экстракцию фенолхлороформом.

Что касается образца одноцепочечной ДНК, повторите этот процесс, используя шесть миллилитров 0,40-молярного фосфатного буфера для элюирования и очистки двухцепочечной ДНК из колонки. Наконец, очистить колонку от любого остаточного дублета многоцепочечной ДНК. Повторите этот процесс еще раз.

На этот раз с использованием шести миллилитров 1,00 молярного фосфатного буфера для обессоливания образцов нуклеиновых кислот. Перенесите от четырех до пяти миллилитров каждого образца в четырехцентробежное фильтрующее устройство Ultra, оснащенное образцом концентрата ультраклеточной мембраны с отсечкой молекулярной массы 30 000 молекулярной массы, до уровня менее 500 микролитров путем вращения при температуре 6 000 GS при 30 градусах Цельсия в течение примерно пяти минут в роторе с фиксированным углом. Отбросив поток, добавьте оставшиеся образцы в фильтр.

Доведите объем до четырех-пяти миллилитров с помощью свободных РНК одного буфера XTE. Затем снова вращайте до тех пор, пока не будет достигнут концентрированный объем. Примерно через пять минут после отжима добавьте четыре-пять миллилитров РНК, освободите один буфер XTE в фильтр и сконцентрируйтесь.

Снова повторите эту промывку и еще пять раз для полного обессоливания образцов нуклеиновых кислот. После того, как образцы будут полностью концентрированы и обессолены, перенесите оставшиеся образцы нуклеиновых кислот в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитров. Осадите нуклеиновые кислоты, добавив одну 10-ю часть объема ацетата натрия, два объема 100% этанола и один микролитр гликосиня, хорошо перемешанных с помощью вихревой центрифуги.

28 000 GS четыре градуса по Цельсию. 60 минут до Кента. Следя за тем, чтобы не потревожить гранулы.

Добавьте 300 микролитров 70% этанола при комнатной температуре 28 000 GS в течение 10 минут, чтобы не высохнуть, и повторно суспендируйте каждую фракцию в соответствующем объеме РНК. Свободный TE-буфер равных концентраций вирусных нуклеиновых кислот M 13 MP 18, одноцепочечной ДНК MS двухцепочечной, РНК FI шести двухцепочечных, РНК и двухцепочечной ДНК лямбды были объединены, а затем разделены с помощью гидроксиапатитовой хроматографии, как показано на этом видео. Равные концентрации M 13 MP 18, одноцепочечной ДНК MS two, одноцепочечной, РНК пять шесть двухцепочечных, РНК и двухцепочечной ДНК Lambda, как показано на шестой дорожке, и нанесены на колонку с гидроксиапатитом, как показано здесь.

Одноцепочечную D-N-A-R-N-A и двухцепочечную ДНК независимо друг от друга выводили из колонки гидроксиапатита с использованием 0,12 моляра, 0,18 моляра, 0,40 моляра и 1,00 молярного фосфатного буфера. Для подтверждения размеров генома использовалась лестница в один КБ. Эти результаты указывают на то, что этот метод может быть использован для успешного разделения одноцепочечной ДНК, двухцепочечной ДНК и РНК с менее чем 9% переноса из одной фракции в другую.

Этот метод также использовался для выделения нуклеиновых кислот, выделенных из вирусного сообщества в Чесапикском заливе, как показано здесь. Одноцепочечную D-N-A-R-N-A и двухцепочечную ДНК независимо друг от друга использовали с использованием фосфатных буферных концентраций 0,12 моляра, 0,20 моляра и 0,40 моляра, или 1,00 моляра соответственно. двухцепочечная ДНК была доминирующим типом нуклеиновой кислоты, выделенной из планктона Verio из Чесапикского залива. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как отделить нуклеиновые кислоты от смешанной вирусной сборки с помощью гидроксиапатитовой хроматографии.

Это включает в себя подготовку колонки гидроксиапатита и нуклеиновых кислот, разделение и иллюзию нуклеиновых кислот с использованием различных концентраций фосфатного буфера и обессоливание, а также концентрирование нуклеиновых кислот после разделения.