Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии
29 сентября 2011 г.
Мы описываем эффективный метод для отдельных одноцепочечных ДНК двухцепочечной молекулы ДНК и РНК от экологической вирусных общин. Нуклеиновых кислот фракционированного использовании гидроксиапатита хроматографии с увеличением концентрации фосфата содержащих буферы. Этот метод позволяет изоляции всех типов вирусных нуклеиновых кислот из проб окружающей среды.
В этом видео показана процедура разделения смешанных вирусных ассоциаций на основе их нуклеинового кислотного состава. Это позволяет изучать таксономическое разнообразие и функциональный потенциал сложных вирусных сообществ. Здесь гидроксиапатит, кристаллическая форма фосфата кальция, используется для разделения нуклеиновых кислот.
Сначала колонку с гидроксиапатитом упаковывают, а затем на колонку наносят уравновешенные очищенные вирусные нуклеиновые кислоты, зарядовое взаимодействие между положительно заряженными ионами кальция гидроксиапатита и отрицательно заряженным фосфатным остовом подтипов нуклеиновых кислот связывает нуклеиновые кислоты с колонкой Nick. Затем одноцепочечная, D-N-A-R-N-A и двухцепочечная ДНК последовательно упоминаются с различными концентрациями фосфатного буфера. Полученные нуклеиновые кислоты затем обессолены и концентрируются при подготовке к визуализации, количественному определению и идентификации с помощью секвенирования ДНК Гель-электрофорез Agros подтверждает, что виды нуклеиновых кислот могут быть разделены с менее чем 9% переноса.
Таким образом, этот метод позволяет оценить разнообразие и функциональную способность вирусных сообществ. Здравствуйте, меня зовут Дуг Фро, и я научный сотрудник в лаборатории доктора Шеннона Уильямсона в Венчурном институте Крейга. Сегодня я покажу вам процедуру отделения одноцепочечной ДНК, двухцепочечной ДНК и РНК от вирусной группы окружающей среды.
Этот метод имеет преимущества по сравнению с существующими методами, такими как обработка ядром, которое нацелено либо на ДНК, либо на РНК. Гидроксиапатитовая хроматография обладает способностью захватывать все вирусное сообщество. Этот метод позволяет ответить на несколько вопросов в области вирусной экологии.
Например, каков общий набор генов или разнообразие вирусного сообщества? Впервые мы подумали об этом методе, когда хотели изучить все комплексы планктона Рио-де-Жанейро из Чесапикского залива, не жертвуя при этом частью генетической сигнатуры. Растворы, необходимые для этого эксперимента, должны быть приготовлены заранее в соответствии с инструкциями в прилагаемом письменном протоколе и включать 0,12 молярного фосфатного буфера, 0,20 молярного фосфатного буфера, 0,40 молярного фосфатного буфера и один молярный раствор фосфата.
При pH 6,8 и гидратированном гидроксиапатите в день эксперимента уравновесьте все фосфатные буферы и гидратированный гидроксиапатит, поместив их в водяную баню при температуре 60 градусов Цельсия. Начните эту процедуру с подготовки колонки econo, которая будет использоваться для разделения вирусных нуклеиновых кислот. Прикрепите запорный кран к концу колонны эконом и убедитесь, что он закрыт.
С помощью пипетки добавьте в колонку деионизированную воду, затем поместите крышку на верхнюю часть колонки и многократно переверните колонку, чтобы промыть ее. Слейте воду и повторите эту промывку несколько раз. Далее снимите запорный кран с колонки экон и автоклавируйте его для стерилизации.
Запорный кран не является автоклавным, так как он будет плавиться. Промойте стопорный кран ионизированной водой, затем еще раз 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе после автоклавирования. Установите на место стопорный кран и закройте его.
Далее, работая в вытяжном шкафу, добавьте в колонну один миллилитр сигма-слоя и покройте стекло колонны, перевернув колонну вращательным движением, как показано здесь. Покрытие сигма-слоем сведет к минимуму прилипание нуклеиновых кислот к поверхности стекла. Во время разделения на поверхности из одного солевого стекла наносится покрытие.
Откройте запорный кран и сцежьте в коническую трубку. Далее, чтобы подключить колонну к циркуляционной водяной бане, с помощью двух хомутов прикрепите колонну к кольцевой подставке. Прикрепите силиконовую трубку от циркуляционной водяной бани, чтобы поток воды из водяной бани шел снизу вверх.
Установите температуру на 60 градусов по Цельсию и запустите циркуляцию. В то время как на практике колонна и трубки должны быть обернуты изоляционным веществом, таким как алюминиевая фольга или изоляция труб из пенопласта. Чтобы свести к минимуму потери тепла, этот шаг здесь не показан.
Для того чтобы лучше визуализировать процедуру, закройте запорный кран. С помощью пипетки добавьте 10 миллилитров стерильной РНК свободной воды. Откройте запорный кран и дайте воде стечь.
Затем снова промойте после второй стирки. Дважды промойте 10 миллилитров стерильных РНК, не содержащих 0,12 молярфосфатного буфера, и сцедите между стирками. Теперь колонка готова к гидроксиапатитовой хроматографии.
Убедитесь, что стопорный кран колонки econ закрыт. Затем с помощью стерильной двухмиллилитровой серологической пипетки медленно добавьте в нижнюю часть колонки два миллилитра подготовленного ресуспендированного регидратированного гидрокси аппетита. Установите на место колпачок колонны.
Дайте гидроксиаппетиту успокоиться под действием силы тяжести в течение 30 минут. Этот метод требует внимания к деталям. Колонка гидроксиаппетита обрабатывает данные со скоростью от 0,25 до 0,5 мил в минуту.
Поэтому очень важно внимательно следить за колонной, чтобы она не пересыхала. По прошествии 30 минут откройте запорный кран, чтобы слить воду из буфера в контейнер для отходов. Закройте запорный кран и сбросьте сквозной поток.
Соедините нуклеиновые кислоты с 0,12 молярного фосфатного буфера в конечном объеме 500 микролитров и инкубируйте его при температуре 60 градусов Цельсия в течение 10 минут. Это уравновесит нуклеиновые кислоты в соответствии с температурой колонки и усилит разделение различных видов нуклеиновых кислот за счет удаления любых вторичных структур, которые могут присутствовать. С помощью двухмиллилитровой серологической пипетки быстро нанесите раствор нуклеиновой кислоты на гидроксиаппетит, следя за тем, чтобы не потревожить колонку.
После того, как все 500 микролитров потекут на колонку, в верхнюю часть колонки можно добавить небольшое количество 0,12 молярного фосфатного буфера, чтобы предотвратить ее высыхание. Дайте нуклеиновым кислотам соединиться с гидроксиаппетитом в течение 30 минут. После инкубации связывания поместите под колонну коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Затем откройте стопорный кран и соберите первоначальный образец объемом 500 микролитров, который содержит одноцепочечную ДНК. Как только будет собрано 500 микролитров, закройте запорный кран. Затем добавьте шесть миллилитров 0,12 молярного фосфатного буфера в гидроксиаппетит, следя за тем, чтобы не потревожить колонку.
Затем откройте запорный кран и продолжайте собирать поток через содержащую синглетную многоцепочечную ДНК в той же 15-миллилитровой пробирке с предыдущего этапа. После того, как будет собрано примерно шесть миллилитров, закройте запорный кран. Добавьте один объем раствора фенолхлороформа изоамилового спирта в пробирку, энергично перемешанную вортексом, затем центрифугируйте при 3,500 G в течение 15 минут.
После центрифугирования пробирка будет содержать два слоя. Перенесите верхний слой согласия, который содержит одну цепь ДНК, в новую пробирку объемом 15 миллилитров и храните образец при комнатной температуре для элюирования и очистки РНК. Из колонки добавьте шесть миллилитров 0,20 молярного фосфатного буфера и соберите проточные отверстия перед использованием новой 15-миллилитровой пробирки. Затем проведите экстракцию фенолхлороформом.
Что касается образца одноцепочечной ДНК, повторите этот процесс, используя шесть миллилитров 0,40-молярного фосфатного буфера для элюирования и очистки двухцепочечной ДНК из колонки. Наконец, очистить колонку от любого остаточного дублета многоцепочечной ДНК. Повторите этот процесс еще раз.
На этот раз с использованием шести миллилитров 1,00 молярного фосфатного буфера для обессоливания образцов нуклеиновых кислот. Перенесите от четырех до пяти миллилитров каждого образца в четырехцентробежное фильтрующее устройство Ultra, оснащенное образцом концентрата ультраклеточной мембраны с отсечкой молекулярной массы 30 000 молекулярной массы, до уровня менее 500 микролитров путем вращения при температуре 6 000 GS при 30 градусах Цельсия в течение примерно пяти минут в роторе с фиксированным углом. Отбросив поток, добавьте оставшиеся образцы в фильтр.
Доведите объем до четырех-пяти миллилитров с помощью свободных РНК одного буфера XTE. Затем снова вращайте до тех пор, пока не будет достигнут концентрированный объем. Примерно через пять минут после отжима добавьте четыре-пять миллилитров РНК, освободите один буфер XTE в фильтр и сконцентрируйтесь.
Снова повторите эту промывку и еще пять раз для полного обессоливания образцов нуклеиновых кислот. После того, как образцы будут полностью концентрированы и обессолены, перенесите оставшиеся образцы нуклеиновых кислот в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитров. Осадите нуклеиновые кислоты, добавив одну 10-ю часть объема ацетата натрия, два объема 100% этанола и один микролитр гликосиня, хорошо перемешанных с помощью вихревой центрифуги.
28 000 GS четыре градуса по Цельсию. 60 минут до Кента. Следя за тем, чтобы не потревожить гранулы.
Добавьте 300 микролитров 70% этанола при комнатной температуре 28 000 GS в течение 10 минут, чтобы не высохнуть, и повторно суспендируйте каждую фракцию в соответствующем объеме РНК. Свободный TE-буфер равных концентраций вирусных нуклеиновых кислот M 13 MP 18, одноцепочечной ДНК MS двухцепочечной, РНК FI шести двухцепочечных, РНК и двухцепочечной ДНК лямбды были объединены, а затем разделены с помощью гидроксиапатитовой хроматографии, как показано на этом видео. Равные концентрации M 13 MP 18, одноцепочечной ДНК MS two, одноцепочечной, РНК пять шесть двухцепочечных, РНК и двухцепочечной ДНК Lambda, как показано на шестой дорожке, и нанесены на колонку с гидроксиапатитом, как показано здесь.
Одноцепочечную D-N-A-R-N-A и двухцепочечную ДНК независимо друг от друга выводили из колонки гидроксиапатита с использованием 0,12 моляра, 0,18 моляра, 0,40 моляра и 1,00 молярного фосфатного буфера. Для подтверждения размеров генома использовалась лестница в один КБ. Эти результаты указывают на то, что этот метод может быть использован для успешного разделения одноцепочечной ДНК, двухцепочечной ДНК и РНК с менее чем 9% переноса из одной фракции в другую.
Этот метод также использовался для выделения нуклеиновых кислот, выделенных из вирусного сообщества в Чесапикском заливе, как показано здесь. Одноцепочечную D-N-A-R-N-A и двухцепочечную ДНК независимо друг от друга использовали с использованием фосфатных буферных концентраций 0,12 моляра, 0,20 моляра и 0,40 моляра, или 1,00 моляра соответственно. двухцепочечная ДНК была доминирующим типом нуклеиновой кислоты, выделенной из планктона Verio из Чесапикского залива. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как отделить нуклеиновые кислоты от смешанной вирусной сборки с помощью гидроксиапатитовой хроматографии.
Это включает в себя подготовку колонки гидроксиапатита и нуклеиновых кислот, разделение и иллюзию нуклеиновых кислот с использованием различных концентраций фосфатного буфера и обессоливание, а также концентрирование нуклеиновых кислот после разделения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод разделения одноцепочечной ДНК, двухцепочечной ДНК и РНК из вирусных сообществ окружающей среды с использованием хроматографии на гидроксиапатитах. Эта методика позволяет изолировать различные типы вирусных нуклеиновых кислот, способствуя дальнейшему изучению вирусного разнообразия и функциональности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирология
- Молекулярная биология
- Экология
Предыстория
- Вирусные сообщества окружающей среды являются сложными и разнообразными.
- Понимание вирусных нуклеиновых кислот имеет решающее значение для изучения их роли в экосистемах.
- Традиционные методы могут неэффективно разделять различные типы нуклеиновых кислот.
- Хроматография на гидроксиапатитах предлагает многообещающее решение для этого разделения.
Цель исследования
- Разработать эффективный метод изоляции вирусных нуклеиновых кислот.
- Улучшить понимание вирусного таксономического разнообразия.
- Подготовить нуклеиновые кислоты для дальнейшего анализа, включая секвенирование.
Используемые методы
- Для разделения нуклеиновых кислот была применена хроматография на гидроксиапатитах.
- Колонка была уложена и эквилибрирована фосфатными буферами.
- Нуклеиновые кислоты были нанесены на колонку и последовательно элюированы.
- Электрофорез использовался для подтверждения эффективности разделения.
Основные результаты
- Одноцепочечная ДНК, двухцепочечная ДНК и РНК были успешно разделены.
- Наблюдалось менее 9% перехода нуклеиновых кислот.
- Метод позволяет эффективно визуализировать и количественно определить нуклеиновые кислоты.
- Результаты поддерживают изучение вирусных ассамблей в экологических образцах.
Выводы
- Метод хроматографии на гидроксиапатитах является эффективным для разделения нуклеиновых кислот.
- Эта методика может способствовать изучению вирусного разнообразия и функциональности.
- Будущие исследования могут строиться на этом методе для более широких приложений в вирусологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Separating nucleic acid subtypes from mixed viral assemblages enables comprehensive characterization of viral diversity without losing genetic signatures, supporting target validation in antiviral discovery. Hydroxyapatite chromatography provides a scalable, reproducible method to isolate ssDNA, dsDNA, and RNA viruses for downstream sequencing and functional assays. This approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery by enabling parallel evaluation of all viral genome types in environmental samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses across all viral genome types in complex assemblages.
- Operational Value: Supports biological de-risking by preserving ssDNA, dsDNA, and RNA viral signatures for parallel target screening.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative nucleic acid yields for each subtype prior to lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, fractionated viral nucleic acid pools for assay development against diverse viral targets.
- Operational Value: Ensures assay readiness through reproducible separation with <9% carryover, enabling reliable compound screening.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple viral community samples with consistent elution profiles using defined phosphate buffer gradients.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from environmental viral sampling to preclinical validation by preserving genotype-specific nucleic acids.
- Mechanistic De-risking: Enables assessment of functional potential across ssDNA, dsDNA, and RNA viruses to inform preclinical model selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing subtype-specific quantification for biomarker alignment in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling fractionation of viral nucleic acids prior to sequencing, assay development, and functional screening, supporting lead identification campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating ssDNA, dsDNA, and RNA viruses for independent functional analysis.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acid fractions with high purity and low carryover, enabling reliable high-throughput screening.
- Analytics: Provides quantitative nucleic acid yields and electrophoretic profiles that allow comparison across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects environmental sampling to preclinical continuity through preserved nucleic acid integrity for downstream validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fractionation platform applicable to diverse viral assemblages across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through comprehensive viral genome representation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of nucleic acid separation across labs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on complete viral diversity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and chromatography techniques.
- Dependence on HPLC-compatible systems and fraction collection infrastructure.
- Need for standardized phosphate buffer preparation and temperature control at 60°C.
- Adaptation considerations for varying viral load and sample complexity from environmental sources.
- Practical limitation: Column equilibration and binding steps require precise timing to prevent nucleic acid degradation or loss.
