Иммуномечение белков нейрональных мембран в сублимационном образце ткани мозга мыши

Возьмите образец ткани мозга мыши в буфере.

Образец покрыт платиной для улучшения деталей поверхности и карбоном для структурной стабильности.

Перенесите образец во флакон с буфером для пищеварения, содержащим моющее средство.

Инкубируйте, чтобы облегчить разрушение тканей, оставляя нетронутыми мембрану и белки, встроенные в покрытие.

Промойте буфером для удаления мусора.

Добавьте блокирующее решение для предотвращения связывания неспецифических антител.

Введите первичные антитела, специфичные для белка мембраны-мишени.

Промойте буфером, чтобы удалить несвязанные антитела.

Инкубируйте с золотыми конъюгированными вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами.

Промойте буфером для удаления лишних антител.

Промойте водой, чтобы предотвратить появление артефактов от остатков соли во время микроскопии.

Установите образец на просвечивающий электронный микроскоп или сетку TEM.

Под TEM визуализируйте целевой белок нейронной мембраны, идентифицированный по золотым частицам, которые выглядят как черные точки.

Для разложения SDS перенесите реплику в стеклянный флакон объемом 4 миллилитра, наполненный 1 миллилитром буфера для SDS-разложения. Дайте ему настояться в течение 18 часов при температуре 80 градусов Цельсия, встряхивая. Для иммуномаркировки промойте реплику в течение 10 минут в свежем буфере для SDS-разложения. Затем инкубируйте его с первичными и вторичными антителами, разведенными в 2% BSA TBS, во влажной камере при температуре 15 градусов Цельсия в течение 24-72 часов.

После этого установите реплику на 100-строчную параллельную стержневую сетку с покрытием formvar. Представьте себе реплику с помощью просвечивающего электронного микроскопа при напряжении 80 или 100 киловольт. Затем получите цифровые изображения с помощью ПЗС-камеры.