Проведение иммуногистохимии на ткани мозга нечеловекообразного примата

Начнем с химически фиксированного участка мозга примата.

Фиксаторы на основе альдегида сшивают белки, сохраняя структуру тканей, но оставляют некоторые реакционноспособные остатки альдегида.

Промойте, чтобы удалить слой криопротектора, окружающий участок ткани.

Добавьте восстановитель для нейтрализации реакционноспособных альдегидных групп, образующих побочные продукты реакции.

Промойте, чтобы удалить эти побочные продукты и излишки восстановителей.

Нанесите блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.

Добавьте первичные антитела, нацеленные на белок, экспрессируемый в определенных участках мембраны нейронов.

Промойте для удаления несвязанных антител.

Добавьте биотинилированные вторичные антитела, нацеленные на первичные антитела.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Наложите авидин-биотин-пероксидазные комплексы, которые связываются с вторичными антителами.

Промойте еще раз, чтобы удалить несвязанные комплексы.

Вместе с перекисью водорода вводят хромогенный субстрат. В присутствии перекиси водорода фермент пероксидаза окисляет субстрат, образуя коричневые осадки.

Начните с переноса участков неподвижного мозга приматов с акролеином толщиной 50 микрон, содержащих интересующую область, на 12-луночный планшет, содержащий PBS. Свободно плавающие секции промойте три раза в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте секции в свежеприготовленном растворе борогидрида натрия в течение 30 минут при комнатной температуре. Покачивайте осторожно без крышки.

По истечении 30 минут аспирируйте борогидрид натрия и добавьте PBS в каждую лунку. Поставьте тарелку на качалку и энергично встряхивайте в течение 10 минут. Повторите промывку еще два раза, или до тех пор, пока не останется реакционного газа. Блокируют срезы путем инкубации в растворе 2% обычной сыворотки и 0,5% холодного рыбного желатина, разведенного в PBS в течение одного часа при комнатной температуре при легком покачивании.

По истечении времени инкубации инкубируйте срезы и раствор первичного антитела с легким покачиванием в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день, после промывания срезов, как и раньше, инкубируйте срезы в растворе вторичных антител в течение 1,5 часов при комнатной температуре с легким покачиванием. После промывки секций, как и раньше, инкубировать в авидине, биотинпероксидазе, или растворе АВС, в течение одного часа с укачиванием.

Далее готовят свежий раствор из разведенного в TBS 0,05% 3,3-диаминобензидина с 0,005% перекисью водорода. После промывки инкубируйте срезы в растворе DAB в течение трех-семи минут с легким покачиванием. Как только коричневый осадок развился до нужного цвета, остановите реакцию, быстро промыв дважды в холодном TBS, затем через серию временных стирок TBS и PB.