Количественный и анализ формирования HO-эндонуклеаза Вынужденное Хромосомные транслокации по однонитевые Отжиг в Saccharomyces CEREVISIAE

Общей целью данной процедуры является определение генетического контроля формирования транслокации одноцепочечным коленопреклонением в диплоидных почковающихся дрожжевых клетках. Это достигается путем первичной инокуляции культур с отдельными колониями определенного генотипа и их выращивания в течение ночи. Вторым этапом процедуры является индуцирование одновременного образования двухцепочечного разрыва эндонуклеазой ho на двух хромосомах путем добавления галактозы к культурам.

Далее разведение этих культур покрывают на селективных и неселективных средах. Заключительным этапом является определение частоты транслокации путем подсчета колоний, возникающих на селективных и неселективных средах. В конечном итоге могут быть получены результаты, которые показывают генетический контроль формирования транслокации одной нитью, коленопреклонение через изменение частоты образования транслокации ho стимулированной у штаммов различных генотипов.

Последствия этого метода распространяются на последствия терапевтического облучения онкологических больных, потому что разрывы двухцепочечной ДНК и образование транслокации являются основными последствиями этого лечения. Для начала процедуры определения частот стимулированных транслокаций инокулируют от 10 до 20 самостоятельных одномиллилитровых культур Y-пиковой лактатной среды глицерина с одиночными колониями нужного генотипа, инкубируют культуры в течение ночи при 30 градусах Цельсия на ротаторе. Когда культуры достигнут желаемой плотности клеток, добавьте 20% галактозы к культурам до конечной концентрации 2%. Галактоза будет индуцировать экспрессию ho эндонуклеазы, которая будет направлять двухцепочечные разрывы в истории дельта пять прим аллеля на хромосоме три и имеет три дельта три прим аллель на хромосоме 15 инкубировать в течение четырех часов при 30 градусах Цельсия на ротаторе.

Следующий шаг имеет решающее значение для успеха процедуры. Тщательное разбавление и покрытие культур является обязательным условием. Если бы вы получили частоты транслокаций, которые были бы достаточно воспроизводимыми, чтобы позволить статистически значимые сравнения между штаммами различного генотипа, через четыре часа планшетом соответствующее разведение культур на среду, лишенную гистидина, а также на YPD td, примерно от 100 до 200 колоний на планшет, инкубируйте планшеты при 30 градусах Цельсия в течение двух-трех дней.

Когда возникают колонии, можно определить частоту транслокации. Эффективность осаждения до и после индукции экспрессии ho-эндонуклеазы покажет, влияет ли наличие или отсутствие какой-либо транслокационной хромосомы на способность выживать при образовании DSB. При этом фрагментируется одна копия хромосомы 3 и хромосомы 15 для определения эффективности предварительного индукционного покрытия.

Сначала удалите аликвоту клеток из каждой ночной культуры и определите количество клеток путем подсчета с помощью гемоцитометра. Затем используйте соответствующее разведение, чтобы поместить примерно от 100 до 200 клеток в YPD, инкубируйте в течение двух-трех дней при 30 градусах Цельсия, пока не возникнут колонии. Добавьте 20% галактозы к оставшимся культурам до конечной концентрации 2% и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение четырех часов, чтобы определить эффективность почтового покрытия.

Удалите аликвоту клеток из каждой культуры через четыре часа индукции и определите количество клеток с помощью гемоцитометра Подсчитайте примерно от 100 до 200 клеток с использованием соответствующего разведения на YPD, инкубируйте в течение двух-трех дней при 30 градусах Цельсия до образования колоний. Как только на пластинах образуются колонии, можно определить эффективность покрытия. Предполагаемые транслокационные клоны-носители могут быть исследованы с помощью южного блоттинга.

В этой процедуре используется геномная ДНК, полученная из одного шипения и рекомбинантной колонии из каждого независимого исследования, расщепляется примерно четыре микрограмма каждого образца ДНК с помощью BAM H, одной эндонуклеазы рестрикции, отдельного BAM H, одного расщепленного фрагмента на 0,7% aros она, а затем переносится на положительно заряженную нейлоновую мембрану, гибридизованную с меченым P 32 зондом, полученным случайным праймингом с 1,8 KILOBASE BMH, одним BMH, одним геномным клоном, содержащим HIS. три гена. Визуализируйте фрагменты ДНК с помощью авторентгенографии или фосфовизуализации. Еще одним способом изучения клонов, несущих предполагаемую транслокацию, является хромосомный анализ графиков.

Хромосомы сначала получают из отобранных шипов плюс рекомбинанты в арос пробках, отдельных хромосомах на 1%-ном геле ароса в контурном зажатом однородном электрическом поле или поваром при 14 градусах Цельсия. Используются следующие параметры: первый блок 14 градусов Цельсия, 72-е время переключения и 15 часов при шести вольтах сантиметра, второй блок, 14 градусов Цельсия, 122-е время переключения и 11 часов при шести вольтах на сантиметр. По завершении электрофореза визуализируйте хромосомы путем окрашивания геля бромидом AUM в течение 30 минут, с последующим облучением ультрафиолетом и задерживанием, а дистиллированная вода переносит хромосомы на положительно заряженную мембрану за счет капиллярного действия.

Условия денатурации гибридизуются с меченым P 32 зондом, полученным случайным праймингом, с 1,8 килооснованием bam H, одним bam H, одним геномным клоном, содержащим шипение. Три гена визуализируют хромосомы с помощью авторадиографии или фосфовизуализации. Частоту хромосомных транслокаций можно рассчитать путем деления числа фототрофных колоний гистамина на общее количество жизнеспособных клеток, определенное путем нанесения на YPD.

В этом примере рассчитанная частота рекомбинации составляет около 3%.Анализ частот транслокации ho может быть проведен с использованием штаммов разных генотипов для сравнения различий в способности восстанавливать двухцепочечные разрывы одноцепочечными. Коленопреклонение, как показано на этом репрезентативном графике. Частоты транслокаций, полученные как селективно, так и неселективно с помощью дельта-нулевой гомозиготы RAD 51, статистически отличались от частот, полученных при соответствующих условиях со штаммом дикого типа как до, так и после индукционного покрытия.

Эффективность определяют путем деления общего числа жизнеспособных колониеобразующих клеток на общее количество клеточных тел в культуре, определенное по количеству гемоцитометра, как показано в данной таблице до и после индукционного осаждения. Эффективность для клеток дикого типа существенно не отличалась, что говорит о том, что наличие или отсутствие любой из транслокационных хромосом не влияет на способность к выживанию. Образование DSB.

Предполагаемые клоны, несущие транслокацию, могут быть изучены с помощью геномного южного блоттинга. Здесь показано графическое представление соответствующих хромосом до и после формирования транслокации. Размеры рестрикционных фрагментов, содержащих релевантные последовательности, полученные в результате однократного расщепления BAM H геномной ДНК родительского и рекомбинантного штаммов и выявленные на блоттинге путем гибридизации с 1,8 килобазой BAM H.

Его три геномных клона перечислены в парах килооснований для анализа методом южного блоттинга. Геномная ДНК расщепляется с помощью одной эндонуклеазы BMH и гибридизуется с P 32, меченным 1,8 килооснованием. HIS три зонда для визуализации этих диагностических фрагментов.

0,8 килобаза HIS три дельта 201,7 килобаза шипение три дельта три простые четыре килобаза T 3 15 5 килобаза T 15 три и восемь килобаза шипение три дельта пять простых фрагментов. Полоса А является родительским диплоидом. Полоса B - это рекомбинантная нереципрокная транслокация, а полоса C - это его плюс реципрокная транслокация.

Рекомбинантный хромосомный анализ BLO также может быть использован для изучения клонов, несущих транслокацию. Неповрежденные хромосомы, приготовленные в пробоках aros, отделяются с помощью электрофореза шеф-повара, а гель окрашивается бромидом иридия и визуализируется под воздействием ультрафиолетового излучения. Затем разделенные хромосомы промокают до нейлона и гибридизуют с P 32, меченным 1,8 килооснованием.

Его три зонда для визуализации 1,1 мегаоснования интактной хромосомы, 15,8 мегаоснования T 15, три транслокационные хромосомы, 0,6 мегаоснования T три 15 транслокационные хромосомы и 0,3 мегаоснования интактной хромосомы три. Полоса А — это развернутый родительский элемент. Полоса В - это А его плюс невзаимная транслокация рекомбинантная, а полоса С - его плюс рекомпрокная транслокация рекомбинантная.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить частоту образования транслокаций после множественных двухцепочечных разрывов.