Конфокальная визуализация движения митохондрий в олигодендроцитах в органотипических культурах срезов мозга

Начните с установки камеры для ванны конфокального микроскопа с циркулирующим раствором для визуализации и контролируемой температурой.

Возьмем гидрофильную полимерную мембрану, содержащую органотипический срез мозга мыши, в котором олигодендроциты были преобразованы для экспрессии специфичного для митохондрий красного флуоресцентного белка и специфичного для цитозоля зеленого флуоресцентного белка.

Двойная флуоресценция позволяет четко визуализировать динамику митохондрий в цитозоле олигодендроцита.

Погрузите кусочек в центр ванны и закрепите его якорем для арфы.

Опустите цель и выберите здоровый олигодендроцит для сканирования.

Отрегулируйте мощность лазера, чтобы свести к минимуму токсичность клеток и фотообесцвечивание.

Установите параметры микроскопа, а затем запишите покадровые изображения флуоресцентно меченых митохондрий.

Захватывайте изображения z-стека на разной глубине, чтобы получить трехмерное изображение всей ячейки с высоким разрешением.

Обработайте изображения, чтобы визуализировать движение митохондрий внутри олигодендроцита.

Используйте щипцы, чтобы перенести конфетти с ломтиком из чашки Петри на верхнюю часть ванны. Затем поместите два кончика щипцов с каждой стороны конфетти так, чтобы они касались конфетти, не касаясь среза. И протолкните конфетти через раствор на дно ванны. Выложите конфетти по центру в центре ванны.

Используйте щипцы, чтобы поместить прижимной якорь или арфу поверх конфетти, не касаясь среза. Затем снова включите перистальтический насос. Опустите объектив вниз к образцу. Затем используйте окуляры и люминесцентную лампу, чтобы быстро найти здоровый на вид олигодендроцит с экспрессией флуоресцентного белка.

Используйте функцию live в программном обеспечении для определения ячейки на экране. И выбрать область интересов. Здесь будет изображена область, содержащая несколько первичных отростков и одну миелиновую оболочку. Увеличьте интересующее вас поле. Обычно при этом получается изображение с размером пикселя от 0,14 до 0,30 микрона.

Выберите инструмент «Регионы» и нарисуйте прямоугольник вокруг области. Выберите опцию сканирования только выбранного региона. Время сканирования и, следовательно, лазерное воздействие сокращается за счет сканирования только выбранной области.

Отрегулируйте мощность и усиление лазера, чтобы получить хороший обзор митохондрий. Используйте низкую мощность лазера и высокий коэффициент усиления, чтобы избежать обесцвечивания во время съемки в реальном времени. При необходимости отрегулируйте цифровое смещение.

Минимизируйте время сканирования, выбрав высокую скорость сканирования. Установите частоту и продолжительность таймлапс-записи для митохондриальной визуализации и олигодендроцитов. Делайте снимки каждые две секунды в течение 20 минут. Запустите цейтраферную запись.

Непрерывный поток решения может вызвать движение среза. Стоит потратить некоторое время на то, чтобы свести к минимуму это движение, регулируя вход и выход ванны. Вы также можете уменьшить частоту вращения насоса.

Постоянно следите за экраном во время съемки с интервальной съемкой, так как небольшие изменения в фокусе обычно все еще происходят. При необходимости отрегулируйте фокусировку. После покадровой визуализации захватите Z-стек всей ячейки для последующей идентификации ячейки и визуализации процесса.