Использование спектральной рефлектометрии для определения диаметров миелинизированных аксонов в неподвижном срезе мозга мыши
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 4:16 мин • May 29th, 2025
Возьмем гиперспектральный конфокальный микроскоп со стабилизированным лазерным источником, настроенным на широкий спектральный диапазон, чтобы расшифровать наноструктуру миелиновой оболочки мозговой ткани.
Используйте эталонное зеркало для захвата базового спектра отражения. Снимите зеркало и получите темный спектр смещения для коррекции шума детектора.
Перенесите камеру с неподвижным срезом мозговой ткани на предметный столик микроскопа.
Выровняйте фокальную плоскость по исследуемой области ткани, обеспечив достаточную глубину для минимизации интерференции от границы стекло-ткань.
Лазерный свет направляется на многослойную миелиновую оболочку аксонов.
Когда свет взаимодействует с миелином, на границах слоев происходят частичные отражения, создавая интерференционные картины из-за различной толщины слоя и показателей преломления.
Получение спектральных изображений этих интерференционных картин.
После коррекции исходной линии и анализа сигнала спектр отражения показывает периодичность волновых чисел, что позволяет определить диаметры миелинизированных аксонов.
Установите эталонное зеркало на предметный столик микроскопа поверхностью объектива. Если поставить зеркало на предметный столик микроскопа непросто, приклейте зеркало к плоской пластине. Отрегулируйте предметный столик микроскопа так, чтобы фокальная плоскость совпала с поверхностью зеркала. Затем отрегулируйте усиление ФЭУ и мощность лазера с учетом динамического диапазона детектора.
Под псевдоцветом проверьте, что нет насыщенности во всем диапазоне длин волн. Если наблюдается насыщение, уменьшите мощность лазера. Затем запустите сбор данных с помощью лямбда-сканирования. Снимите зеркало со сцены и повторите то же самое извлечение без образца, чтобы получить темный эталон. Затем сохраните данные в формате TIFF с несколькими стопками.
Чтобы получить изображение с помощью SpeRe, поместите установленную ткань на предметный столик микроскопа. Чтобы примерно выровнять ткань по фокальной плоскости линзы объектива, через окуляр, используйте широкопольный флуоресцентный режим. Когда сканирование в реальном времени включено, управляйте предметным столиком микроскопа, чтобы выровнять фокальную плоскость по интересующей области ткани. Чтобы избежать фонового шума от покровного стекла, выберите целевую область глубиной не менее 15 микрометров от границы раздела стеклянной ткани.
Получите стек спектральных изображений для целевой области с помощью той же процедуры, что и в этом видео. Затем сохраните данные для ткани и смещения в темном свете в формате TIFF с несколькими стопками. Чтобы обработать изображения в ImageJ, откройте спектральные данные для эталонного зеркала и мозговой ткани.
Выберите ROI для открытых стеков изображений, центральную область для эталонного зеркала и сегмент волокна аксона для ткани мозга. Затем запустите изображение, сгруппируйте и построите профиль оси Z, чтобы получить исходные спектры для выбранных ROI.
Волокна аксонов могут быть структурно неоднородными по всей длине, поэтому рекомендуется выбирать ROI на небольшом сегменте аксона, обычно менее 5 микрометров, чтобы свести к минимуму артефакты частичного объема.
Откройте данные темного смещения, одно из которых взято для эталонного зеркала, а другое — для ткани мозга, и постройте профиль оси Z, как показано выше. Затем используйте функции копирования и вставки, чтобы сохранить все приобретенные опции.
Обзор
В данной статье демонстрируется применение спектральной рефлектометрической микроскопии (SpeRe) с использованием гиперспектрального конфокального микроскопа для анализа наноструктуры миелинизированных аксонов в фиксированных срезах тканей мозга. Путем регистрации и анализа интерференционных картин, создаваемых многослойной миелиновой оболочкой, исследователи могут с высокой точностью определять диаметры аксонов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Микроскопия
- Оптическая визуализация
Теоретическая база
- Миелинизированные аксоны имеют решающее значение для быстрой передачи сигналов в нервной системе.
- Традиционные методы измерения диаметра аксонов могут быть инвазивными или не обладать наноразмерным разрешением.
- Оптические интерференционные картины, возникающие в многослойных миелиновых оболочках, обеспечивают неразрушающий способ оценки структуры аксонов.
- Гиперспектральная конфокальная микроскопия позволяет проводить детальный спектральный анализ биологических тканей.
Цель исследования
- Продемонстрировать протокол использования спектральной рефлектометрии для анализа миелинизированных аксонов in situ.
- Представить метод точного определения диаметра аксонов в фиксированных срезах тканей головного мозга.
- Показать применение гиперспектральной конфокальной микроскопии в нейробиологических исследованиях.
Используемые методы
- Подготовка фиксированных срезов ткани мозга для визуализации.
- Использование гиперспектрального конфокального микроскопа со стабилизированным источником лазерного излучения, охватывающим широкий спектральный диапазон.
- Сбор базовых спектров отражения с использованием эталонного зеркала и спектров темного тока для коррекции шума.
- Настройка фокальной плоскости на интересующую область ткани с обеспечением достаточной глубины от границы раздела стекло-ткань.
- Сбор стеков спектральных изображений миелинизированных аксонов и контрольных областей.
- Обработка изображений и спектральный анализ с помощью ImageJ для извлечения спектров отражения и определения диаметра аксонов.
Основные результаты
- Интерференционные картины, создаваемые миелиновой оболочкой, были успешно зафиксированы с помощью спектральной рефлектометрии.
- Коррекции базовой линии и темнового смещения обеспечили точность спектральных измерений.
- Анализ спектра отражения выявил периодичность волновых чисел, соответствующую диаметру аксона.
- Выбор небольших областей интереса позволил минимизировать артефакты, вызванные гетерогенностью аксонов.
Выводы
- Спектральная рефлектометрическая микроскопия представляет собой неразрушающий метод высокого разрешения для анализа структуры миелинизированных аксонов in situ.
- Данный протокол позволяет точно измерять диаметр аксонов в фиксированной ткани мозга.
- Этот подход может способствовать проведению углубленных исследований микроструктуры нейронов и патологий, связанных с миелином.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для данной отрасли
Количественное измерение диаметров миелинизированных аксонов с помощью спектральной рефлектометрии позволяет проводить структурный анализ с высоким разрешением, который имеет решающее значение для поиска лекарственных средств в области нейробиологии. Этот подход повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижении механистических рисков для активов портфеля препаратов для ЦНС. Интеграция точных показателей аксонов в рабочие процессы раннего этапа поиска лекарств улучшает трансляционную преемственность и позволяет принимать решения с учетом скорректированных рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить количественный анализ микроструктуры нейронов, имеющий значение для моделей заболеваний.
- Способствует снижению механических рисков за счет обеспечения прямых измерений архитектуры миелиновой оболочки.
- Обеспечивает уверенную валидацию мишеней для путей, связанных с миелином, и нейродегенеративных состояний.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка валидированных систем тканей мозга для последующего скрининга соединений.
- Обеспечение воспроизводимых количественных результатов при оценке диаметра аксонов.
- Поддержка стандартизации анализа и повторного использования платформы в нейробиологических исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет структурные показатели с биомаркерами, имеющими значение для заболевания, для проведения трансляционных исследований.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации в программах изучения ЦНС.
- Обладает прогностической ценностью для оценки целостности миелина в доклинических моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Измерение аксонов методом спектральной рефлектометрии вписывается в континуум от ранних этапов поиска до доклинических исследований, поддерживая как проверку гипотез, так и согласование трансляционных биомаркеров.
- Биология открытий: предоставляет количественные структурные данные для валидации мишеней на основе гипотез.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые стандартизированные измерения для разработки аналитических методов.
- Аналитика: генерирует спектральные показатели, позволяющие проводить прямое сравнение характеристик аксонов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает результаты фундаментальных открытий со стратегиями поиска доклинических биомаркеров в исследованиях ЦНС.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования методов визуализации и анализа для портфелей исследований в области нейробиологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в ЦНС.
- Операционная ценность: Стандартизирует высокоразрешающее измерение аксонов для масштабируемых рабочих процессов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала в нейробиологических программах.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию активов для ЦНС с учетом рисков на основе количественных структурных конечных точек.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы с гиперспектральной конфокальной микроскопией и спектральным анализом.
- Необходим доступ к стабилизированным источникам лазерного излучения и современной инфраструктуре визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация процесса получения изображений и выбора ROI.
- Адаптация для различных типов тканей может потребовать оптимизации протокола с целью коррекции глубины проникновения и фона.
- Артефакты частичного объема и гетерогенность тканей должны устраняться путем тщательного выбора ROI.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в Axon ветвление и морфогенеза нейронов
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист
Похожие видео
0 Просмотры
Нелинейная оптика без этикеток для изучения тубулин-зависимых дефектов в центральном миелине
Похожие видео
0 Просмотры
Органотипической Анализ фрагментов для высокого разрешения Time-Lapse Визуализация миграции нейронов в послеродовой мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Электрофизиологическое исследование ретиногеникулатных и кортикогеникулатных синапсов в срезах мозга мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Измерение нейронной активности в срезе мозга мыши после длительной инкубации
Похожие видео
0 Просмотры
Двухфотонная микроскопия для изучения притяжения микроглиального процесса к соединению в срезе мозга мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация морфологии астроцитов с помощью флуоресцентного ионофореза красителя в неподвижном срезе мозга мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Когерентная антистоксова рамановская спектроскопия для визуализации миелинизированных нейронов в тканях мозга мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026