Использование спектральной рефлектометрии для определения диаметров миелинизированных аксонов в неподвижном срезе мозга мыши

Возьмем гиперспектральный конфокальный микроскоп со стабилизированным лазерным источником, настроенным на широкий спектральный диапазон, чтобы расшифровать наноструктуру миелиновой оболочки мозговой ткани.

Используйте эталонное зеркало для захвата базового спектра отражения. Снимите зеркало и получите темный спектр смещения для коррекции шума детектора.

Перенесите камеру с неподвижным срезом мозговой ткани на предметный столик микроскопа.

Выровняйте фокальную плоскость по исследуемой области ткани, обеспечив достаточную глубину для минимизации интерференции от границы стекло-ткань.

Лазерный свет направляется на многослойную миелиновую оболочку аксонов.

Когда свет взаимодействует с миелином, на границах слоев происходят частичные отражения, создавая интерференционные картины из-за различной толщины слоя и показателей преломления.

Получение спектральных изображений этих интерференционных картин.

После коррекции исходной линии и анализа сигнала спектр отражения показывает периодичность волновых чисел, что позволяет определить диаметры миелинизированных аксонов.

Установите эталонное зеркало на предметный столик микроскопа поверхностью объектива. Если поставить зеркало на предметный столик микроскопа непросто, приклейте зеркало к плоской пластине. Отрегулируйте предметный столик микроскопа так, чтобы фокальная плоскость совпала с поверхностью зеркала. Затем отрегулируйте усиление ФЭУ и мощность лазера с учетом динамического диапазона детектора.

Под псевдоцветом проверьте, что нет насыщенности во всем диапазоне длин волн. Если наблюдается насыщение, уменьшите мощность лазера. Затем запустите сбор данных с помощью лямбда-сканирования. Снимите зеркало со сцены и повторите то же самое извлечение без образца, чтобы получить темный эталон. Затем сохраните данные в формате TIFF с несколькими стопками.

Чтобы получить изображение с помощью SpeRe, поместите установленную ткань на предметный столик микроскопа. Чтобы примерно выровнять ткань по фокальной плоскости линзы объектива, через окуляр, используйте широкопольный флуоресцентный режим. Когда сканирование в реальном времени включено, управляйте предметным столиком микроскопа, чтобы выровнять фокальную плоскость по интересующей области ткани. Чтобы избежать фонового шума от покровного стекла, выберите целевую область глубиной не менее 15 микрометров от границы раздела стеклянной ткани.

Получите стек спектральных изображений для целевой области с помощью той же процедуры, что и в этом видео. Затем сохраните данные для ткани и смещения в темном свете в формате TIFF с несколькими стопками. Чтобы обработать изображения в ImageJ, откройте спектральные данные для эталонного зеркала и мозговой ткани.

Выберите ROI для открытых стеков изображений, центральную область для эталонного зеркала и сегмент волокна аксона для ткани мозга. Затем запустите изображение, сгруппируйте и построите профиль оси Z, чтобы получить исходные спектры для выбранных ROI.

Волокна аксонов могут быть структурно неоднородными по всей длине, поэтому рекомендуется выбирать ROI на небольшом сегменте аксона, обычно менее 5 микрометров, чтобы свести к минимуму артефакты частичного объема.

Откройте данные темного смещения, одно из которых взято для эталонного зеркала, а другое — для ткани мозга, и постройте профиль оси Z, как показано выше. Затем используйте функции копирования и вставки, чтобы сохранить все приобретенные опции.