Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Общая цель этой процедуры заключается в криоконсервации эмбрионов мышей в жидком азоте и их размораживании для восстановления живых мышей. Это достигается путем погружения эмбрионов мышей в уравновешивающую среду, переноса их в среду для витрификации в криопробирке, а затем помещения в резервуар с жидким азотом. Более поздние эмбрионы могут быть разморожены в среде с высоким содержанием осмотизма и инкубированы в культуральной среде до тех пор, пока они не будут перенесены в самок-реципиентов.

В конечном счете, результаты показывают выживаемость более 90% эмбрионов после витрификации, размораживания, а рождаемость составляет от 30 до 70% после переноса эмбрионов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что проницаемый криопротектор гликоль менее токсичен для эмбрионов, чем обычный криопротектор. Демонстрировать процедуру будет техник из моей лаборатории Перед началом этого протокола.

Подготовьте два эмбриона клеточной мыши в культуре, полученной естественным спариванием или обычными методами ЭКО, к криопробирке для возможного хранения, добавьте 50 микролитров раствора для замораживания эмбрионов EF S 40. Затем приготовьте 35-миллиметровую или 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри с 50 микролитрами комнатной температуры. ЭФС 20.

Используйте стеклянный капилляр, чтобы перенести в чашку до 30 эмбрионов. Будьте осторожны, избегайте переноса питательной среды. Также чтобы обеспечить обезвоживанию эмбрионов, поместите их на дно капли.

Примерно через 60–90 секунд используйте капиллярную трубку для забора обезвоженных эмбрионов. С усохшей морфологией. Переместите эти эмбрионы в раствор EFS в криопробирке, перенося как можно меньше EFS 20.

После переноса эмбрионов дайте им отстояться в EFS 40 в течение одной минуты, прежде чем заморозить их в жидком азоте. Перед размораживанием эмбрионов поместите в культуральную чашку не менее двух капель 10 мкл питательной среды для эмбрионов с высокой осмолярностью, такой как среда М 16. Затем полностью покройте капли силиконом или минеральным маслом, и поместите чашку в инкубатор с углекислым газом до использования.

Далее разогрейте TS one solution до 37 градусов Цельсия, надев маску для лица и криоперчатки. Извлеките эмбрионы из резервуара с жидким азотом. Теперь быстро откройте криопробирку и сбросьте жидкий азот в бак или любую подходящую емкость.

Затем подождите 30 секунд. Теперь добавьте в криопробирку 850 микролитров теплого ТС одного раствора. Аккуратно всосайте и опустите раствор около 10 раз, чтобы он равномерно растворился.

Затем переложите весь объем в пластиковую 60-миллиметровую чашку Петри. Или понаблюдайте за стеклом три минуты, пока эмбрионы не уравновесятся до комнатной температуры, где они должны оставаться до конца процедуры. Не используйте согревающее устройство.

Быстро изучите эмбрионы в чашке под стереомикроскопом, чтобы узнать, как они выглядят в начале этой инкубации. Примерно через две минуты инкубации утопите эмбрионы, осторожно встряхивая чашку, пока среда не рассыплется по поверхности чашки. В последнюю минуту инкубации вылейте в посуду три отдельные капли по 50 микролитров ТС двух растворов.

По истечении трех минут используйте стереомикроскоп, чтобы подтвердить, что эмбрионы немного уменьшились. Если эмбрионы все еще набухли, продолжайте инкубацию еще одну-три минуты. Теперь поднимите зародыши стеклянным капилляром и перенесите их в первую каплю ТС два.

Подождите три минуты и перенесите эмбрионы во вторую каплю. За ним следует третья капля. Наконец, достаньте подготовленную чашку для эмбрионов, хранящуюся в инкубаторе, и с помощью стеклянного капилляра перенесите эмбрионы в первую каплю среды.

При исследовании под стереоскопом эмбрионы должны медленно восстанавливать свою нормальную морфологию. Теперь верните блюдо в инкубатор примерно на 10 минут. Затем смыть сахарозу, которая была перенесена из TS two.

Переместите эмбрионы в следующую каплю питательной среды. Продолжайте культивировать эмбрионы в CO2-инкубаторе до тех пор, пока они не будут перенесены в инкубатор самок-реципиентов. После витрификации и восстановления от 300 до 480 эмбрионов трех различных линий мышей выживаемость была очень высокой.

После размораживания доля эмбрионов с нормальной морфологией составляла от 93 до 99%, и из этих эмбрионов по крайней мере 84% развились в бластные цисты. Не забывайте, что работа с утечкой азота может быть чрезвычайно опасной, и принимайте меры предосторожности, чтобы избежать прямого контакта и свести к минимуму воздействие утечек на короткие расстояния. Азот всегда следует брать при выполнении этой процедуры.