Измерение экспрессии белка в мозге грызунов с помощью флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне и сканирования с высоким разрешением

Возьмите предметное стекло, содержащее срезы ткани мозга крысы, иммуноокрашенные на рецепторы AMPA и NMDA в нейронах миндалевидного тела.

Рецепторы AMPA опосредуют глутамат-индуцированный приток натрия и быструю возбуждающую синаптическую передачу.

Напротив, NMDA-рецепторы опосредуют глутамат и коагонист-индуцированный приток натрия и кальция, способствуя медленной возбуждающей синаптической передаче.

Рецепторы окрашиваются первичными антителами и обнаруживаются с помощью вторичных антител, помеченных флуорофорами ближнего инфракрасного диапазона.

Поместите предметное стекло тканевой стороной вниз на интерфейс сканирования ближнего инфракрасного диапазона.

Отрегулируйте параметры визуализации и начните визуализацию.

При лазерном освещении флуорофоры на рецепторах AMPA и NMDA излучают флуоресценцию.

Изображение в ближнем инфракрасном диапазоне сводит к минимуму автофлуоресценцию, повышая четкость сигнала.

Сканирование с высоким разрешением также обеспечивает четкую дифференциацию флуоресцентных сигналов, что позволяет точно визуализировать близлежащие рецепторы AMPA и NMDA в миндалевидном теле.

Используя программное обеспечение для визуализации, рассчитайте отношение интенсивности флуоресценции AMPA/NMDA в определенной области интереса в качестве маркера обучения и памяти.

Поместите предметные стекла на интерфейс сканирования в ближнем инфракрасном диапазоне тканью вниз. Отображайте несколько слайдов одновременно с помощью инструмента выделения. Изображения слайдов с использованием максимальной настройки качества с разрешением 21 микрометр. Со смещением 0 нанометров импортируйте изображения в программу анализа изображений для просмотра и пометки для полуколичественного анализа белков.

После открытия программы анализа изображений выберите рабочую область, в которую было отсканировано изображение. Затем откройте отсканированное изображение в программном обеспечении для анализа изображений, чтобы просмотреть скан, и отрегулируйте отображаемые длины волн, контрастность, яркость и увеличение, не изменяя исходное изображение или общее количественное излучение.

После определения ключевых областей для количественной оценки выберите вкладку «Анализ» в верхней части страницы, затем выберите «Нарисовать прямоугольник», чтобы нарисовать прямоугольник над областью, которая будет количественно определена. Чтобы просмотреть размер прямоугольника, выберите «Фигуры» в левом нижнем углу экрана. Затем выберите «Столбцы» в правом нижнем углу. Затем добавьте столбцы «Высота» и «Ширина», чтобы определить размер фигуры. Наконец, назовите фигуру и повторите. После того, как выборка будет выполнена во всех регионах, перейдите к объединению и анализу данных, доступных на вкладке Столбцы.