Почему отношение интенсивности флуоресценции AMPA/NMDA имеет значение для валидации мишени?

Отношение интенсивностей флуоресценции AMPA/NMDA служит маркером синаптической пластичности, а также процессов обучения и памяти, обеспечивая количественный показатель для оценки влияния соединений на глутаматергическую передачу в миндалевидном теле.

Как изоляция сигналов AMPA- и NMDA-рецепторов способствует работе конвейера поиска новых лекарств?

Независимая визуализация флуоресценции AMPA- и NMDA-рецепторов позволяет точно измерить баланс экспрессии рецепторов, что имеет решающее значение для оценки механизма действия соединений, модулирующих синаптическую передачу.

Какие измерения количественных зависимых переменных позволяют проводить скрининг соединений?

Полуколичественные измерения интенсивности флуоресценции AMPA- и NMDA-рецепторов в определенных областях интереса позволяют объективно сравнивать изменения в экспрессии рецепторов при различных экспериментальных условиях.

Почему требования к репликации имеют значение для кросс-функционального взаимодействия?

Репликация обеспечивает согласованное и надежное получение данных в разных лабораториях и группах, что необходимо для повышения уверенности в результатах валидации мишеней и обеспечения воспроизводимости доклинических данных.

Какие навыки статистического анализа необходимы перед внедрением данного метода?

Метод требует возможности количественного определения интенсивности флуоресценции, расчета соотношений и проведения статистических сравнений между группами для оценки значимых изменений в экспрессии рецепторов, связанных с маркерами обучения и памяти.

Измерение экспрессии белка в мозге грызунов с помощью флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне и сканирования с высоким разрешением

JoVE Encyclopedia of Experiments

Нейронауки

0 просмотров • 3:03 мин • May 29th, 2025

Возьмите предметное стекло, содержащее срезы ткани мозга крысы, иммуноокрашенные на рецепторы AMPA и NMDA в нейронах миндалевидного тела.

Рецепторы AMPA опосредуют глутамат-индуцированный приток натрия и быструю возбуждающую синаптическую передачу.

Напротив, NMDA-рецепторы опосредуют глутамат и коагонист-индуцированный приток натрия и кальция, способствуя медленной возбуждающей синаптической передаче.

Рецепторы окрашиваются первичными антителами и обнаруживаются с помощью вторичных антител, помеченных флуорофорами ближнего инфракрасного диапазона.

Поместите предметное стекло тканевой стороной вниз на интерфейс сканирования ближнего инфракрасного диапазона.

Отрегулируйте параметры визуализации и начните визуализацию.

При лазерном освещении флуорофоры на рецепторах AMPA и NMDA излучают флуоресценцию.

Изображение в ближнем инфракрасном диапазоне сводит к минимуму автофлуоресценцию, повышая четкость сигнала.

Сканирование с высоким разрешением также обеспечивает четкую дифференциацию флуоресцентных сигналов, что позволяет точно визуализировать близлежащие рецепторы AMPA и NMDA в миндалевидном теле.

Используя программное обеспечение для визуализации, рассчитайте отношение интенсивности флуоресценции AMPA/NMDA в определенной области интереса в качестве маркера обучения и памяти.

Поместите предметные стекла на интерфейс сканирования в ближнем инфракрасном диапазоне тканью вниз. Отображайте несколько слайдов одновременно с помощью инструмента выделения. Изображения слайдов с использованием максимальной настройки качества с разрешением 21 микрометр. Со смещением 0 нанометров импортируйте изображения в программу анализа изображений для просмотра и пометки для полуколичественного анализа белков.

После открытия программы анализа изображений выберите рабочую область, в которую было отсканировано изображение. Затем откройте отсканированное изображение в программном обеспечении для анализа изображений, чтобы просмотреть скан, и отрегулируйте отображаемые длины волн, контрастность, яркость и увеличение, не изменяя исходное изображение или общее количественное излучение.

После определения ключевых областей для количественной оценки выберите вкладку «Анализ» в верхней части страницы, затем выберите «Нарисовать прямоугольник», чтобы нарисовать прямоугольник над областью, которая будет количественно определена. Чтобы просмотреть размер прямоугольника, выберите «Фигуры» в левом нижнем углу экрана. Затем выберите «Столбцы» в правом нижнем углу. Затем добавьте столбцы «Высота» и «Ширина», чтобы определить размер фигуры. Наконец, назовите фигуру и повторите. После того, как выборка будет выполнена во всех регионах, перейдите к объединению и анализу данных, доступных на вкладке Столбцы.