Двухфотонная микроскопия для мониторинга динамики кальция в фоторецепторах колбочек сетчатки мыши

Поместите покровное стекло, содержащее мембранную ткань сетчатки мыши, под двухфотонный микроскоп.

Ткань экспрессирует биосенсор кальция на основе FRET в колбочках фоторецепторов.

Используя объектив для погружения в воду, сосредоточьтесь на ткани.

При фоновом освещении окончания аксонов конуса остаются деполяризованными, что способствует притоку кальция.

Внутриклеточное связывание кальция изменяет конформацию биосенсора, сближая донор и акцепторные флуорофоры.

Начните двухфотонную визуализацию.

Лазер микроскопа фокусирует низкоэнергетический свет ближнего инфракрасного диапазона в ткани.

В фокусной точке лазера два фотона одновременно возбуждают биосенсор, запуская передачу энергии от донора к акцептору.

Это увеличивает акцепторную флуоресценцию при одновременном снижении донорной флуоресценции.

Рассчитайте коэффициент флуоресценции.

Далее подайте световую стимуляцию для гиперполяризации колбочек, снижая внутриклеточный уровень кальция.

Это обращает конформацию биосенсора, препятствуя передаче энергии от донора к акцептору и снижая коэффициент флуоресценции.

Запишите реакции для анализа вызванной светом динамики кальция в окончаниях аксонов колбока.

Перенесите срез из камеры выдержки в камеру записи и немедленно начните перфузию его карбоксигенированным внеклеточным раствором. Поддерживайте скорость перфузионного потока 2 миллилитра в минуту и температуру 37 градусов Цельсия в записывающей камере. Используйте 20-кратный объектив с водяным погружением 0,95 NA и ПЗС-камеру в сочетании с инфракрасным светодиодом под камерой записи, чтобы определить местоположение среза сетчатки.

Запустите двухфотонную систему визуализации, как указано производителем. Далее включите лазер и установите его на 860 нанометров. Включите два канала детектирования для флуоресцентной визуализации ECFP и цитрина. Затем с помощью программного обеспечения для получения изображений управляйте двухфотонным микроскопом для сканирования и выберите ряд конусных клемм для записи. Установите для параметра Получение изображений значение 128 на 16 пикселей или аналогичную конфигурацию.

Ограничьте сканируемую область конусообразными окончаниями, чтобы избежать обесцвечивания фотопигментов в наружных сегментах. Включите лазер. Дайте колбочкам адаптироваться к сканирующему лазеру и фоновому свету стимула в течение 20–30 секунд, прежде чем предъявлять световые стимулы или применять фармакологические средства. Теперь приступаем к представлению произвольных стимулов. Стимулы генерируются путем модуляции интенсивности двух светодиодов с течением времени с помощью микропроцессорной платы, управляемой специализированным программным обеспечением. Затем начните одновременную запись двух флуоресцентных каналов с помощью соответствующего программного обеспечения для получения изображений.