Двухфотонная микроскопия для мониторинга динамики кальция в фоторецепторах колбочек сетчатки мыши

Поместите покровное стекло, содержащее мембранную ткань сетчатки мыши, под двухфотонный микроскоп.

Ткань экспрессирует биосенсор кальция на основе FRET в колбочках фоторецепторов.

Используя объектив для погружения в воду, сосредоточьтесь на ткани.

При фоновом освещении окончания аксонов конуса остаются деполяризованными, что способствует притоку кальция.

Внутриклеточное связывание кальция изменяет конформацию биосенсора, сближая донор и акцепторные флуорофоры.

Начните двухфотонную визуализацию.

Лазер микроскопа фокусирует низкоэнергетический свет ближнего инфракрасного диапазона в ткани.

В фокусной точке лазера два фотона одновременно возбуждают биосенсор, запуская передачу энергии от донора к акцептору.

Это увеличивает акцепторную флуоресценцию при одновременном снижении донорной флуоресценции.

Рассчитайте коэффициент флуоресценции.

Далее подайте световую стимуляцию для гиперполяризации колбочек, снижая внутриклеточный уровень кальция.

Это обращает конформацию биосенсора, препятствуя передаче энергии от донора к акцептору и снижая коэффициент флуоресценции.

Запишите реакции для анализа вызванной светом динамики кальция в окончаниях аксонов колбока.

Перенесите срез из камеры выдержки в камеру