Изоляция и характеристика Hoechst ^Низкий CD45 ^{Отрицательный} Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

В этом видео демонстрируется протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток легких с низким уровнем CD 45. Тканевые резонансные мезенхимальные стволовые клетки или МСК являются важными регуляторами восстановления или регенерации тканей, фиброза, воспаления и ангиогенеза. Сначала у принесенной в жертву мыши препарируют легкие.

Легочная ткань переваривается с получением одноклеточной суспензии. Клетки окрашивают ложным штампом и CD 45 и сортируют с помощью проточной цитометрии для получения отрицательных МСК легких с низким содержанием CD 45. Затем легочные МСК наращивают в культуре и проводят колониеобразующий анализ для оценки возможностей дифференцировки МСК.

Затем могут быть проведены дальнейшие исследования для изучения роли МСК во время тканевого гомеостаза и заболевания. Метод, который мы здесь показываем, может быть использован для выделения мезенхимальных стволовых клеток легких мыши или человека и может быть применен для исследования заболеваний легких, таких как легочный фиброз, легочная гипертензия и ХОБЛ. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за разнообразия доступных методов подготовки тканей, а также настройки проточного цитометра, соответствующего контроля и анализа.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку трудно описать правильную технику измельчения и переваривания легочной ткани для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток только словами. Кроме того, настройка прибора для проточной цитометрии и анализ лучше всего передаются посредством демонстрации. Начните этот протокол с удаления легких, которые будут использоваться для получения мезенхимальных стволовых клеток от принесенной в жертву взрослой мыши.

С помощью небольших острых ножниц разрежьте грудную клетку сбоку с каждой стороны мыши. Откройте грудную полость, затем снимите диафрагму. Введите 10-миллилитровый шприц с иглой 20 с половиной калибра в правый желудочек сердца и аккуратно нажмите на поршень, чтобы перфузировать его тремя-пятью миллилитрами PBS, смывая кровь из легких.

Далее с помощью ножниц отрежьте трахею и большой бронх и выбросьте их. Затем с помощью щипцов. Возьмите маленькие белые доли легких и поместите их в чашку Петри, наполненную буферным физиологическим раствором Хэнка или HBSS.

Затем удалите сердце и отделите доли легких. Повторите этот процесс для всех мышей в исследовании. Перенесите доли легких на крышку посуды.

Смочите ткань ровно настолько, чтобы они не высыхали. Затем с помощью одноразового скальпеля измельчите доли легких, чтобы получить костный мозг, чтобы использовать поддерживающий контроль для проточной цитометрии. С помощью острых ножниц разрежьте лодыжку и верхнюю часть бедренной кости.

Поместите конечность в новую чашку Петри. Затем отрежьте колено, оставив линейный кусок бедренной кости и второй кусок, содержащий большеберцовую и малоберцовую кости. С помощью щипцов оттяните мышцу, чтобы открыть большеберцовую кость, малоберцовую кость и бедренную кость.

Теперь возьмите пятимиллилитровый шприц с иглой 26 с половиной калибра и введите иглу в отверстие костного мозга. На одном конце большеберцовой кости удерживайте кость другим концом, направленным в 50-миллилитровую коническую трубку, наполненную 15 миллилитровым HBSS, и нажмите на поршень, чтобы дозировать HBSS и смыть костный мозг в трубку. Повторите этот процесс с малоберцовой и бедренной костью.

Окрашивание костного мозга хозяином 3 3 3 4 2 погибает при конечной концентрации пяти микрограммов на миллилитр в добавке DMEM с высоким содержанием глюкозы. Затем из изолированной ткани будет сгенерирована одноклеточная суспензия легочной ткани. Поместите каждое легкое в пробирку с предварительным содержанием 0,2% Worthington.

Коллагеназа второго типа готовится в стерильном HBSS, затем погружается в пробирку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и выдерживается в течение 30 минут. После инкубации используйте пипетку объемом 10 миллилитров для тритования образца до тех пор, пока диджест не будет легко проходить через пипетку. Примерно 10 повторений инкубируются в течение дополнительных 15 минут, 37 градусов по Цельсию для завершения переваривания тканей.

После того, как расщепление будет завершено, разбавьте клеточную суспензию HBSS и используйте пятимиллилитровую пипетку, чтобы повторить попытку диспергирования любых остаточных фрагментов ткани. Далее, чтобы удалить непереваренные фрагменты тканей, вылейте суспензию через 70 микромолярное сетчатое фильтр в 50 миллилитровую коническую трубку. Добавляйте суспензию понемногу, чтобы образец прошел через сетчатое фильтр.

Если непереваренные фрагменты тканей полностью блокируют течение клеточной суспензии. Перелейте через новую ячейку ситечко в новую пробирку. Гранулируйте ячейку суспензией в течение 10 минут при температуре 450 RCF.

Следя за отжимом, сцедите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу при комнатной температуре. Эритроциты лизируют буфером, инкубируют комнатной температурой в течение пяти минут. Затем добавьте равный объем HBSS, чтобы инактивировать буфер для лизиса.

Налейте клеточную суспензию в клеточный фильтр объемом 40 микромоляров, чтобы удалить мусор и клеточные агрегаты, собирая поток в новой конической пробирке объемом 50 миллилитров. Затем с помощью гемоцитометра определите количество клеток как для образцов легких, так и для образцов костного мозга. Запишите концентрацию и общий объем клеточной суспензии.

Затем гранулируйте суспензию одиночных клеток легких центрифугированием при 450 RCF в течение 10 минут. Для поддержания клеток происходит одновременная суспензия клеток легких и костного мозга. От 10 до шести клеток на миллилитр в предварительно подогретом дополнении с высоким содержанием глюкозы DMEM.

Чтобы окрасить ДНК, добавьте краситель HOAXED 3 3 3 4 2 до конечной концентрации пять микрограммов на литр. Далее перемешайте клетки путем щадящей инверсии и выдержите на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия ровно 90 минут. Затем центрифугируйте в течение 10 минут при 450 Gs при четырех градусах Цельсия после отжима.

Продолжайте окрашивание ткани легких и костного мозга анти-CD 45 и йодидом пропидия для подготовки к анализу методом проточной цитометрии. После окрашивания клеток храните пробирки на льду, защищенном от света, до тех пор, пока не будет проведен анализ проточной цитометрии. Подготовьтесь к проточной цитометрии, убедившись, что лазеры инструментов выровнены и что они настроены на сортировку клеток.

Используемый прибор должен быть оснащен синим 488 нанометровым красным 635 нанометровым и ультрафиолетовым 350-355 нанометровым лазерами с двумя детекторами на УФ-лазерной трассе с синим 45 на 65 и красным 6 75 на 50 фильтрами. Кроме того, УФ-красный детектор должен обладать высокой чувствительностью к красному сигналу, а прибор должен быть оснащен охладителем для поддержания температуры образца при температуре 10 градусов Цельсия. В программном обеспечении прибора настроены графики гистограммы для отображения линейного прямого и бокового рассеяния, график дискриминации дублета, подходящий для прибора.

Гистограмма PI с использованием логарифмического сигнала, красное и синее побережье с использованием линейных сигналов и гистограмма CD 45 A PC с использованием логарифмического сигнала. Когда инструмент будет готов, поместите окрашенный образец костного мозга в загрузочное отверстие инструмента. Этот образец используется в качестве инструмента для окрашивания и настройки прибора.

Начните сбор событий и настройте форвард внутри линейных сигналов разброса. Чтобы четко визуализировать популяцию клеток, ячейки должны находиться примерно в нижнем центре графика по оси x. Поскольку ядерное окрашивание PI проникает через мембрану IMP, оно будет исключено из живых клеток.

Нарисуйте область походки на PI-положительных мертвых клетках на гистограмме PI. Дайте указание программному обеспечению прибора раскрасить мертвые клетки. В этих воротах красный.

Полезно использовать цветные вентилируемые мертвые клетки в качестве навигатора для идентификации популяции хозяина G zero G one. Пятно PI также возбуждается ультрафиолетовым лазером, и большинство мертвых клеток должны быть вне накипи. В правой части графика красной и синей фальшивой флуоресценции популяцию костного мозга G zero G one следует рассматривать как плотный кластер событий на красном и синем фальшивом графике.

Отрегулируйте напряжения детектора так, чтобы кластер G zero G one находился в правом верхнем углу центра графика. Часть S-фазы и весь G-2 клеточного цикла могут отклоняться от нормы. В верхнем правом углу красного и синего фальшивого графика видно, как низкое количество хостов популяции тянется от левой стороны кластера G zero G one вниз к нижнему левому углу графика.

Теперь нарисуйте ворота вокруг кластера ячеек в режиме FSC против SSC. Постройте график популяции синглетов, идентифицированной на дуплетном графике, и живых клеток на гистограмме PI. Затем назначьте диаграмму-мистификацию для отображения только этих закрытых популяций.

После закладки основного графика нарисуйте область вокруг бокового населения. Назначьте эту область в качестве затвора для гистограммы CD 45 A PC вместе с синглетами рассеяния света и вентилами живых клеток. Теперь, когда система настроена, извлеките образец из загрузочного отверстия и поместите образец легкого в загрузочное отверстие.

Для данного образца не нужно повторно настраивать параметры прибора. Начните собирать события на сюжете мистификации красных против синих. Кластер G zero G one для образца легких обычно выглядит более вытянутым в направлении оси x и напоминает символ тильды на клавиатуре.

Боковая популяционная ложная походка должна быть в том же положении, что и для образца костного мозга. Эти небольшие корректировки в большую или меньшую сторону могут быть необходимы для обеспечения жесткого разрешения боковой популяции. Поддерживайте низкий перепад давления во время сортировки, следя за тем, чтобы клапан потока пробы не был открыт слишком сильно.

Затем, чтобы изолировать MSC, поместите планшет для сбора 96 лунок в сортировочную камеру и установите сортировочные затворы на гистограмме CD 45 A PC, чтобы разделить положительную и отрицательную популяцию. Наконец, собирают клетки либо как смешанную популяцию в пробирку, либо как отдельные клетки для выделения клонов в 96-луночный планшет, после сбора МСК легких путем сортировки клеток помещают клетки в 30-миллиметровые чашки с использованием МЭМ, дополненного 20% FBS. Во-первых, отсортированные ячейки кажутся маленькими, круглыми и яркими примерно через две-три недели.

Колонии с мезенхимальным фенотипом становятся очевидными, а пролиферация более очевидна для каждого клеточного препарата. Оценить способность МСК легкого дифференцироваться в традиционные мезенхимальные линии остеобластов, адипоцитов и хондроцитов и экспрессию принятых мезенхимальных маркеров на их клеточной поверхности. Проведите цитогенетический анализ запретов, чтобы подтвердить отсутствие грубых хромосомных аномалий.

После выделения с помощью проточной цитометрии и получения клонов одиночных клеток проводится колониеобразующий анализ для характеристики клеток МСК и их возможностей к дифференцировке. Начните с разбавления клеток в три раза по 10 из четырех клеток на миллилитр. Неполноценную среду в 100-миллиметровую посуду, разведение зерновых культур два, шесть раз по 10 из четырех, три раза по 10 из четырех, 1,5 раза по 10 на четыре и 0,75 раза по 10 на четыре клетки на чашку в 10 миллилитровых средах в трех экземплярах.

Затем поместите пластины в инкубатор через 10 дней после культивирования, слейте среду и промойте клетки PBS. Затем зафиксируйте их, добавив 100% метанол на пять минут при комнатной температуре. Через пять минут слейте метанол.

Затем, чтобы обнаружить образование колоний, добавьте 0,4% массы по объему gza, разведенный один к 20 с ионизированной водой, инкубируйте от 10 до 15 минут. Затем слейте пятно и прополощите ионизированной водой. Дайте образцам высушиться на воздухе и количественно оцените количество колоний, содержащих более 25 клеток на колонию, с помощью инвертированного микроскопа или визуализации.

Колонии большие и состоят из нескольких сотен клеток, как показано здесь, и демонстрируют мезенхимальный фенотип. МСК были изолированы, как показано на этом видео, и покрыты 96 луночными планшетами, имитирующими рост. Затем к МСК легких добавляли меченые CFSE антигенпрезентирующие клетки.

Пролиферацию выделенных МСК затем измеряли как снижение средней интенсивности флуоресценции CFSE по сравнению с фоном, который был мечен CFSE только Т-клетками, как показано на этом рисунке, при отсутствии СК легких и наличии антигенпрезентирующих клеток, A PC плюс минус O альбумин CD 40 положительные эффективные Т-клетки демонстрируют снижение интенсивности CFSE, что указывает на распространение, обведенное красным цветом. Интенсивность флуоресценции CFSE мембраны Т-клеток уменьшается эконометрически с каждым делением клетки, т.е. наполовину при каждом делении легких в присутствии M-S-C-A-P-C плюс минус OVA CD 40 положительно пораженные Т-клетки не демонстрируют существенного изменения интенсивности CFSE, что указывает на отсутствие пролиферации после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области биологии стволовых клеток легких к изучению роли мезенхимальных стволовых клеток при заболеваниях легких, таких как легочная артериальная гипертензия и легочный фиброз.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять часов После этой процедуры. Другие методы, такие как дифференцировочные анализы, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, в том числе, демонстрируют ли предполагаемые мезенхимальные стволовые клетки легких надлежащую многолинейную дифференцировку, потенциал к костному жиру и хрящам.