Концентрация метаболита с низкой плотностью планктонных сообществ экологической метаболомики использованием ядерного магнитного резонанса
7 апреля 2012 г.
Метод метаболитов извлечения из микробных сообществ планктона представлена. Всего выборки сообщества достигается путем фильтрации на специально подготовленных фильтров. После лиофилизации, водно-растворимых метаболитов выделяются. Такой подход позволяет для применения экологических метаболомики к транс-omics исследования природных и экспериментальных микробных сообществ.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса обладает рядом явных преимуществ для исследований в области экологической метаболомики, однако в данной процедуре она характеризуется относительно низкой чувствительностью. Описан метод фильтрации для концентрирования и экстракции метаболитов всего сообщества из планктонных систем, подходящий для ЯМР. Это достигается путем предварительной специальной подготовки фильтров для сбора образцов путем удаления вымываемых веществ.
Вторым этапом процедуры является фильтрация образца (естественного или экспериментального) через фильтры. Третьим этапом является лиофилизация материала образца и экстракция метаболитов. Заключительным этапом процедуры является анализ образцов с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса и соответствующая интеграция данных.
В конечном итоге с помощью метаболомных и трансамных подходов можно получить результаты, демонстрирующие метаболические изменения в природных образцах в зависимости от экологических градиентов или в ответ на экспериментальные манипуляции. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как центрифугирование, является возможность отбора проб всего сообщества, а также использование больших объемов образцов для проб с низкой плотностью. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения смесей металлов в окружающей среде, например, о том, как рост микроорганизмов реагирует на изменения окружающей среды. Демонстрация данной процедуры будет проведена на базе моей лаборатории.
Начните выполнение данного протокола с помещения фильтров в чистый 500-миллилитровый стакан Pyrex с помощью пинцета. Залейте фильтры дистиллированной водой для предварительного промывания, тщательно перемешав содержимое круговыми движениями, чтобы предотвратить слипание фильтров. Слейте воду и повторите промывку дважды.
После окончательного промывания добавьте в стакан 300 миллилитров воды Milli Q и подвергните фильтры автоклавированию. После автоклавирования фильтров слейте воду Milli Q и трижды промойте фильтры, как и ранее, но используя воду Milli Q.
С помощью пинцета поместите отдельные фильтры на чистую сухую поверхность, например, на алюминиевую фольгу, и высушите их при подходящей температуре. Например, при 37 °C или путем высушивания на воздухе; теперь фильтры готовы к использованию для демонстрации данного протокола. С соблюдением правил асептики используется трехместный фильтрационный коллектор Millipore из нержавеющей стали, оснащенный микроаналитическими фильтрующими колонками диаметром 25 мм со стеклянными supports и механическим насосом.
Поместите один фильтр диаметром 25 миллиметров на основание фильтрующей колонки. Установите колонку и закрепите устройство зажимом. Введите в колонку 15 миллилитров образца, полученного из микрокосма с высоким содержанием питательных веществ.
Откройте стопорный клапан на фильтрационном коллекторе и включите фильтрующий насос, создав небольшое давление, чтобы минимизировать разрушение клеток. Для образцов с низкой плотностью может потребоваться последовательное добавление воды. Следите за тем, чтобы фильтр не оставался сухим в течение длительного времени между добавлениями воды.
Во-вторых, может быть выполнено снижение содержания остаточных парамагнитных солей в морских образцах и, по желанию, промывка пресной водой. По завершении фильтрации выключите насос и оставьте клапан открытым, чтобы под фильтром сохранялось отрицательное давление. Одной рукой снимите зажим и колонку фильтра.
С помощью чистого пинцета захватите фильтр. Сложите фильтр пополам, стараясь не создавать заломов. Используйте край стерильной микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл, чтобы прижать фильтр.
Поместите фильтр в пробирку объемом 2 мл и отпустите его так, чтобы он раскрылся стороной с образцом внутрь. Немедленно заморозьте в жидком азоте для экстракции водных растворимых метаболитов. Сначала лиофилизируйте образцы в течение ночи или не менее 10 часов; после лиофилизации добавьте в каждую пробирку стальной измельчитель.
Добавьте 750 µL стандартизированного калий-фосфатного буфера и оксида дейтерия со стандартом DSS. Обработайте образцы ультразвуком в течение пяти минут при 4 °C в ультразвуковой бане, чтобы удалить клеточный материал с фильтра. Извлеките фильтры чистым пинцетом.
Разрушьте клетки с помощью мельницы-измельчителя при 1600 RPM в течение пяти минут. Затем инкубируйте при 65 °C. Перемешивайте на лабораторном шейкере в течение 15 минут.
После инкубации извлеките металлический гомогенизатор с помощью чистых пинцетов. Центрифугируйте образец при 13, 000 G в течение пяти минут. После центрифугирования слейте супернатант и перенесите его непосредственно в пробирку для ЯМР-спектроскопии.
Загрузите образец в ЯМР-спектрометр. Анализ образцов проводится на спектрометре Bruker DRX 500, оснащенном зондом TXI с трехосевым градиентом, при температуре 298 Kelvin. Выполните синхронизацию (lock), настройку (tune) и шиммирование магнита.
Получите одномерные спектры ПМР, используя интерфейс TopSpin и ранее описанные методы, или воспользуйтесь другим программным обеспечением интерфейса спектрометра по мере необходимости. В данной работе спектры регистрировали с подавлением сигналов остаточной воды с помощью импульсной последовательности Watergate при времени повторения 1,2 секунды. В настоящем примере для каждого образца было собрано 128 транзиентов.
Перенесите каталоги с данными ЯМР на персональный компьютер с установленным программным обеспечением NMR pipe. Обработайте необработанные данные, установите сигнал DSS в качестве нулевого эталона PPM, а затем выполните ручное фазирование спектров. Оцифруйте спектральные данные методом биннинга с помощью общедоступного пакета FT two B с сайта электронной коммерции.
Для биннинга также могут быть использованы другие программные утилиты, такие как RNMR или Atomics. Данные могут быть нормализованы по общему сигналу или сигналу DSS для отображения пропорциональных изменений сигнала между образцами. Полученные данные теперь можно использовать для последующего статистического анализа, например, для анализа главных компонент (PCA) с помощью бесплатных программных пакетов, таких как показанный R.
Ниже представлен пример спектров ПМР, полученных с использованием продемонстрированной методики. Спектры соответствуют двум временным точкам эксперимента в микрокосме и демонстрируют явные различия, обусловленные метаболической активностью водорослей. На спектре четвертого дня наблюдается значительное количество пиков, особенно в диапазоне от 3 до 4 ppm, по сравнению с образцом первого дня.
Эти пики могут быть обусловлены сахарами, вырабатываемыми цветущими диатомеями внутри микрокосма. В аналогичном эксперименте для сравнения роста природных планктонных сообществ в искусственной и природной морской воде использовался график счетов PCA, полученный с помощью программы Mr.Spectra, отображающий две первые главные компоненты. Данный статистический подход позволяет преобразовать многомерные данные в более простой формат — в данном случае двумерный, — что наглядно выявляет структуру взаимосвязей между лежащими в основе точками данных.
Каждая из осей или обе они здесь более схожи. Наблюдаются явные метаболические различия между двумя вариантами обработки. Данные этого эксперимента были использованы для проведения мультиомного анализа.
Сочетание ЯМР с данными о составе геномного сообщества, полученными с помощью электрофореза в денатурирующем градиентном геле генов 18S и 16S-РРНК, также выявляет отчетливые различия в структуре микробных сообществ между микрокосмами с природной и искусственной морской водой. Такое соответствие между метаболомом и геномом в природных системах демонстрирует эффективность данного подхода. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости использования соответствующих методов для минимизации контаминации после завершения протокола.
Для ответа на дополнительные вопросы, например, о том, как микробиом коррелирует с определенными метаболитами, могут быть применены другие методы, такие как корреляционный анализ на омиксном уровне.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод извлечения метаболитов из микробных планктонных сообществ с использованием ядерного магнитного резонанса. Процедура включает фильтрацию на специально подготовленные фильтры, лиофилизацию и последующую экстракцию водорастворимых метаболитов, что способствует проведению исследований в области экологической метаболомики.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Экологическая метаболомика
- Микробная экология
- Ядерно-магнитный резонансная спектроскопия
Теоретические основы
- Экстракция метаболитов имеет решающее значение для изучения микробных сообществ.
- Ядерно-магнитный резонанс позволяет определить состав метаболитов.
- Методы фильтрации способствуют повышению концентрации метаболитов в образцах.
- Данный подход может быть применен как к природным, так и к экспериментальным микробным системам.
Цель исследования
- Разработать надежный метод экстракции метаболитов из микробных планктонных сообществ.
- Обеспечить возможность детального анализа метаболитов с помощью ЯМР-спектроскопии.
- Способствовать развитию области экологической метаболомики.
Используемые методы
- Подготовка фильтров для удаления вымываемых веществ.
- Фильтрация микробных образцов на подготовленные фильтры.
- Лиофилизация материала образца.
- Экстракция водорастворимых метаболитов для анализа.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно концентрировать и экстрагировать метаболиты из микробных сообществ.
- ЯМР-спектроскопия эффективно используется для анализа экстрагированных метаболитов.
- Этот подход применим как к природным, так и к экспериментальным образцам.
- Результаты способствуют пониманию метаболических профилей микробных сообществ.
Выводы
- Данный метод расширяет возможности изучения микробной метаболомики.
- Он создает основу для будущих исследований в области экологической метаболомики.
- Дальнейшее применение метода позволит получить новые данные о взаимодействиях и функциях микроорганизмов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Экологическая метаболомика сталкивается с проблемами чувствительности при изучении микробных сообществ с низкой плотностью, что ограничивает применение ЯМР в рабочих процессах на этапе первичного поиска. Данный метод концентрирования на основе фильтрации позволяет осуществлять нетаргетное профилирование метаболитов в планктонных системах, что способствует формулировке гипотез в микробной экологии и поиску трансляционных биомаркеров. Повышая детектируемость метаболитов, этот подход увеличивает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижает риски при изучении механизмов для применения в области охраны окружающей среды и здоровья.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, фиксируя сдвиги метаболитов всего сообщества в ответ на воздействия окружающей среды.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированные протоколы подготовки фильтров и лизиса для снижения технической вариативности при экстракции метаболитов.
- Стратегическая ценность: способствует сортировке портфеля препаратов за счет воспроизводимого обнаружения биомаркеров-метаболитов, связанных с путями микробного стресса или адаптации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего ЯМР-скрининга путем концентрирования водорастворимых метаболитов из образцов с низкой плотностью.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа с помощью лиофилизации и экстракции буфером из фосфата калия, что повышает воспроизводимость результатов между сериями экспериментов.
- Стратегическая ценность: Повышение готовности к скринингу для изучения эффектов соединений в моделях микробных кокультур или синтетических сообществ.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает моделирование систем, имеющих значение для изучения заболеваний, обеспечивая корреляцию метаболома и генома в естественных и искусственных микрокосмах морской воды.
- Практическая ценность: Обеспечивает трансляционную непрерывность за счет интеграции мультиомных данных, связывая спектры метаболитов с данными о геномном составе сообщества.
- Стратегическая ценность: Помогает принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем развитии исследований путем выявления устойчивых метаболических признаков в различных экологических градиентах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска, обеспечивая проверку гипотез в микробных системах, переходит к скринингу посредством стандартизированной экстракции метаболитов и поддерживает трансляционные исследования за счет сопоставления мультиомных данных.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению метаболических путей путем выявления изменений метаболитов в планктонных сообществах при различных экспериментальных воздействиях.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и количественные результаты за счет определения концентраций метаболитов, детектируемых методом ЯМР после фильтрации и лизиса.
- Аналитика: позволяет получать спектральные данные, подходящие для статистического анализа, такого как PCA, что дает возможность сравнивать условия и распознавать закономерности.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями через соответствие метаболома и генома в природных системах, поддерживая подбор биомаркеров.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает многократно используемую платформу для фильтрации и экстракции, применимую к различным моделям водных микроорганизмов.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неоднозначности ответов микробных метаболитов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря предварительной подготовке фильтров и автоматизированным этапам лизиса.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), обеспечивая воспроизводимые профили метаболитов для снижения биологических рисков.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков на основе детектируемых сдвигов метаболитов, связанных с фенотипами роста или стресса микроорганизмов.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области методов фильтрации, лиофилизации и подготовки образцов для ЯМР, чтобы избежать загрязнения и обеспечить максимальный выход метаболитов.
- Необходим доступ к ЯМР-спектрометрам с функцией подавления сигнала воды, а также к программному обеспечению для обработки и биннинга спектров.
- Требуется межкомандная стандартизация правил работы с фильтрами, составов экстракционных буферов и протоколов нормализации данных для получения воспроизводимых результатов.
- Необходимо учитывать особенности адаптации к различной плотности образцов, что может потребовать последовательных фильтраций или корректировки объема для сообществ с низкой численностью.
- Существуют практические ограничения, такие как влияние остаточных парамагнитных солей в морских образцах, что требует проведения дополнительных этапов промывки для сохранения качества спектра.
