Ингибирование нейронной активности и ее выявление с помощью электрофизиологии у крысы

Начните с крысы под наркозом, закрепленной в стереотаксической рамке с обнаженным черепом.

Используя анатомические ориентиры, брегму и лямбду, обнаруживают верхний колликулус, глубокую структуру мозга, отвечающую за обработку визуальной информации.

Просверлите, чтобы создать костный лоскут, снимите его и наложите буфер, чтобы поддерживать гидратацию мозга.

Расположите инжектор в сборе, состоящем из микропипетки с электродом, прикрепленным к микрошприцу.

Микропипетка содержит ингибирующий раствор нейромедиатора для подавления возбудимости нейронов, в то время как электрод одновременно регистрирует активность нейронов.

Опустите инжектор в верхний бугорок и покройте открытую поверхность расплавленным агаром для предотвращения обезвоживания.

Настоящий свет вспыхивает в глаз, стимулируя нейроны и вызывая синхронизированные потенциалы действия.

Введите нейромедиатор, который связывается с его рецепторами и запускает приток ионов хлора.

Этот приток гиперполяризует мембранный потенциал, тем самым подавляя потенциалы действия.

По мере того, как концентрация нейротрансмиттеров со временем снижается, активность нейронов восстанавливается.

Чтобы подготовить записывающие инъекционные пипетки, сначала вытяните 7-сантиметровый капилляр с наружным диаметром 1 миллиметр. Для вертикального полицейского модели 720 или аналогичного устройства установите нагреватель на 18, а соленоид на единицу. Далее, надев перчатки, вручную сломайте наконечник, чтобы сделать отверстие и проверьте под микроскопом, что внутренний диаметр составляет от 30 до 40 микрометров. Измерьте это с помощью линейки видоискателя. Он будет производить относительно низкое сопротивление от 0,3 до 0,6 мегаом.

Затем с неконического конца вставьте в пипетку серебряную проволоку длиной около 7 сантиметров, и оставьте от 1 до 2 сантиметров свисающим из пипетки. Согните эту лишнюю проволоку ортогонально капилляру. Далее возьмите иглу для подкожных инъекций 30 калибра и нанесите на вал гибкий пластичный клей. Затем медленно введите иглу в пипетку как можно дальше.

Добавьте еще клея, чтобы создать уплотнение в месте соединения между пипеткой и иглой. Кончиком пипетки вверх дайте сборке высохнуть в течение примерно 12 часов. После обезболивания и помещения крысы в стереотаксическую рамку нанесите офтальмологическую мазь, выбрейте ей голову начисто.

После применения местного анестетика и подтверждения хирургического плана анестезии приступайте к надрезу волосистой части головы по срединной поверхности с использованием лезвия скальпеля номер 10. При этом обнажаются коронарные и сагиттальные швы. Затем с помощью хирургического шпателя определите анатомические референсы лямбда и брегма.

Отрегулируйте положение головы так, чтобы эти ориентиры находились на одном уровне в одной горизонтальной плоскости. Затем обнулите тонкую жесткую указку, похожую на стеклянную трубку на брегме. Затем отрегулируйте положение трубки в интересующем вас месте, используя координаты брегмы.

С помощью шарпи нарисуйте квадрат вокруг целевой области для трепанации черепа. Теперь с помощью хирургической стерилизованной бормашины медленно удалите кость по следам. Начните с минимального давления и продолжайте двигать сверло, чтобы избежать повреждения тканей головки из-за трения.

Когда косточка стала тонкой, аккуратно удалите квадратный срез пинцетом. Твердую мозговую оболочку не нужно удалять, так как стержень для впрыска проникнет в нее. В дальнейшем следите за тем, чтобы открытая кора головного мозга орошалась спинномозговой жидкостью. Приготовьте инжектор, сначала наполнив минеральным маслом шприц объемом от 5 до 10 микролитров. Далее приготовьте интересующее лекарственное средство с красителем в физиологическом растворе. Здесь 0,5% Chicago Sky Blue смешивается с 300 микромолярной ГАМК.

Теперь заполните пипетку для инъекций, сначала загрузив приготовленным раствором шприц объемом 1 миллилитр, а затем с помощью шприца загрузите пипетку. При извлечении шприца сохраняйте легкое давление на поршень, чтобы вакуум не удалял раствор из инжектора. Проверьте наличие утечки жидкости в возможных местах утечки. Промокните лишнюю жидкость и еще раз проверьте ее на герметичность.

Теперь приложите микрошприц с минеральным маслом к инжектору. Затем сотрите излишки раствора марлей. Проверьте наконечник для инъекции. Через него должна быть возможность пропускания небольших капель раствора. В противном случае он заблокирован или протекает. Теперь надежно закрепите инжекторный стержень в микронасосной системе. Затем переместите положение инжектора в целевые координаты и опустите электрод к верхнему холму, который может быть идентифицирован путем регистрации визуальных вызванных потенциалов.

Пока электрод опущен, приложите небольшое положительное давление, применяя низкую скорость впрыска, чтобы избежать засорения. Прервите инъекцию, когда структура будет достигнута. После введения инжектора накройте обнаженную кору теплым агаром для предотвращения высыхания.

После окончательной установки электрода подождите 30 минут, чтобы обеспечить стабилизацию тканей, окружающих электрод. Затем вводите от 400 до 800 нанолитров раствора со скоростью 40 нанолитров в минуту до инактивации нейронной активности в верхнем холмике. Электрод должен показывать уменьшение спайков во время введения ингибирующего раствора.