Субпиальная доставка генов в спинной мозг мыши для оценки экспрессии генов

Возьмите мышь под наркозом, побрейте ей спину, продезинфицируйте кожу.

Надрежьте кожу, отделите мышцы от позвонков и втяните их с помощью зажимов.

Просверлите пластинки позвонков, чтобы создать трещины, затем удалите костные фрагменты, чтобы обнажить твердую мозговую оболочку, внешнюю оболочку спинного мозга.

С помощью иглы создайте отверстие для твердой мозговой оболочки и проколите нижележащую мозговую оболочку, чтобы войти в субпиальное пространство для прямого доступа к спинномозговым тканям.

Возьмите иглу для доставки, содержащую суспензию рекомбинантного аденоассоциированного вируса, несущего ген, экспрессирующий флуоресцентный белок, и введите суспензию.

Извлеките иглу, зашите мышцы и кожу и дайте мышке восстановиться.

Вирус связывается с рецепторами на нейронах и глиальных клетках и эндоцитозируется.

Попадая внутрь ядра, вирус запускает экспрессию генов для производства флуоресцентных белков.

Субпиальная модель доставки генов теперь готова для оценки экспрессии целевых генов в спинном мозге.

Начните с правильной анестезии животного перед операцией. Здесь используется изофлуран. Прежде чем продолжить, убедитесь в отсутствии реакции на щипок лапы. Затем накройте глаза офтальмологической мазью. Далее выбрейте спину животного машинками для стрижки, а кожу очистите 2% хлоргексидином.

Если необходимо выполнить поясничные субпиальные инъекции, разрежьте скальпелем кожу над позвонками от T8 до L1. А затем с помощью ножниц отсоедините паравертебральную мышцу от Т10 до Т12 спинных позвонков. Установите животное в стандартную стереотаксическую раму с помощью спинальных зажимов мыши. Затем с помощью бормашины сброй обеих сторон пластинки позвонков от Т10 до Т12 до появления трещин.

Затем с помощью щипцов удалите треснувшие костные отломки и обнажите дорсальную поверхность поясничного отдела спинного мозга. Теперь видна твердая мозговая оболочка. С помощью иглы из нержавеющей стали 30 калибра сделайте надрез от 1 до 2 миллиметров в твердой мозговой оболочке.

Важно аккуратно разрезать твердую мозговую оболочку, чтобы избежать травмирования нижележащей мембраны пиа.

Теперь возьмитесь за край разрезанной твердой мозговой оболочки щипцами и продлите отверстие твердой мозговой оболочки на 5 миллиметров. Установите проникающую иглу pia 34 калибра и инъекционную иглу 36 калибра на Z-рычаги двух отдельных манипуляторов XYZ с помощью стеклянных капиллярных держателей.

Затем используйте микрошприц объемом 50 микролитров, соединенный с трубкой PE-10 или PE-20, чтобы загрузить вирус AAV9-UBI-GFP. После того, как вирус загрузится, подсоедините конец трубки к игле для инъекций. Затем, глядя через хирургический препарирующий эндоскоп, установленный на 8-10-кратное увеличение, используйте руку X, чтобы опустить проникающую иглу pia в pia на глубину 1 миллиметр. Держите угол проникающей иглы от 5 до 10 градусов относительно поверхности ткани.

После вскрытия pia с помощью X-образного рычага удалите проникающую иглу pia из субпиального пространства. Обратите внимание на место проникновения с помощью ориентира, например, кровеносного сосуда. Переместите рычаги X, Y и Z второго манипулятора, чтобы поместить кончик инъекционной иглы AAV9, наполненной вирусом, в место, где проникает пиа.

Затем, после введения кончика инъекционной иглы примерно на 0,5 миллиметра в субпиальное пространство, используйте Z-образный рычаг, чтобы поднять пиа примерно на 0,3 миллиметра, затем используйте X-образный рычаг, чтобы продолжить продвижение иглы горизонтально в субпиальное пространство. Продвигайте иглу до тех пор, пока она не войдет в подпятое пространство на глубину примерно от 2 до 3 миллиметров.

Затем с помощью микрошприца объемом 50 микролитров введите вирус AAV9-UBI-GFP в субпиальное пространство. Извлеките иглу для инъекций из подкожного пространства после завершения инъекции AAV9-UBI-GFP. Закройте мышцы и кожу с помощью шва из фтормоноволокна и хирургических зажимов. Дайте животному восстановиться на грелке перед помещением в чистую клетку.