Визуализация вируса денге через Alexa Fluor маркировки

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы флуоресцентно пометить вирус денге для микроскопических исследований. Приготовьте необходимые буферы и очистите вирус денге с помощью подушки из сахарозы, восстановите проточный краситель Amy React Alexa и вирус денге в буфере для маркировки. Пометьте вирус денге сотней микромоляров потока Alexa.

Умрите на один час и остановите реакцию мечения субреагентом. Очистите этикетку от вируса денге с помощью столбца исключения размера. Ретитрируйте меченый вирус с помощью анализа бляшек и оцените степень мечения с помощью иммунофлуоресцентного анализа.

Здравствуйте, я Сэм Джанг из Национальных лабораторий DSO, работаю в лаборатории доктора Ви по программе новых инфекционных заболеваний после окончания медицинской школы NUS. Сегодня я покажу вам, как флуоресцентно мечить вирус Denki с помощью антигриппозного красителя Amy Reactive Alexa для визуализирующих исследований. Alexa, умирающие от гриппа, обладают превосходной стабильностью и менее чувствительны к pH, чем обычные диеты, такие как флюоресцеин и рубец, что делает их идеальными для исследований клеточного поглощения и эндосомального транспорта вируса.

Вирус денге, меченный Alexa flaw, облегчит понимание патогенеза денге. Итак, приступим. Перед реакцией мечения приготовьте свежий буфер для мечения и остановите реагент в соответствии с письменным протоколом и очистите вирус денге сахарозной подушкой, добавьте соответствующий объем очищенного вируса денге в буфер для мечения в микроцентрифужной пробирке для достижения концентрации 300 миллионов образующих единиц на миллилитр.

Это может быть пропорционально увеличено. Для пакетной маркировки вирусов. Восстановите лиофилизированный напольный краситель Alexa до одного миллимольяра в буфере для мечения непосредственно перед реакцией мечения.

Сведите к минимуму воздействие света, начиная с этого этапа. В демонстрационных целях краситель для пола Alexa будет оставлен незащищенным от света на 800 микролитров одного миллимоляра. Alexa flow die до разбавленного вируса денге при осторожном перемешивании с помощью наконечника микропипетки.

Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света, смешивать с помощью легких инверсий каждые 15 минут через час, Центрифугировать пробирки кратко. 800 микролитров подобласти при осторожном взгляде микропипеткой инкубируют еще один час при комнатной температуре. Защищен от света производится с помощью мягких инверсий каждые 15 минут.

В то же время он приравнивает очистную колонну к 25 миллилитрам буфера HNE. После одночасовой инкубации нанесите помеченный вирус на столбец и начните собирать поток. Заполните столбец буфером HNE.

После того, как весь меченый вирус попадет в матрицу, отбросьте первые 2,5 миллилитра проточного потока и соберите следующие два миллилитра меченой фракции вируса. Экор и увидел очищенный меченый вирус при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Определите наименование меченого вируса с помощью анализа бляшек.

В типичном эксперименте должно наблюдаться менее чем десятикратное снижение названия вируса. После мечения следует провести иммунофлуоресцентный анализ для оценки степени мечения. Для этого перечислите вирусные клетки с помощью гемоцитометра и подберите соответствующий объем клеток к питательным средам, чтобы достичь плотности 50 000 клеток на миллилитр.

Смотрите на один миллилитр вирусных клеток на лунку в четырехлуночном планшете, содержащем стерильную стеклянную крышку. Спать. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Выньте планшет из инкубатора и аспирируйте супинатор из скважины собственно клеток с примерно одним MOI меченого вируса в объеме ста микролитров в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Удалите инокулюм и промойте клетки 0,5 миллилитрами буфера PBS на лунку. Спирит дис и повторите эту процедуру еще два раза. Зафиксируйте ячейки с 200 микролитрами 3% на лунку при комнатной температуре на 30 минут.

Промойте клетки три раза 0,5 миллилитрами PBS буфера на лунку. Ализируйте ячейки раствором изационного раствора при комнатной температуре в течение 30 минут. Снимите крышку сна с хорошо с помощью тонких щипцов.

Слейте лишнюю жидкость, очистив край крышки DP. Приложите к белой бумаге. Поместите ячейку стороной крышки.

Спите на 25 микролитрах антител к белку денге на кусочке отдушки. Выдерживать в течение одного часа во влажной камере при комнатной температуре, защищенной от света. Затем перенесите крышку на шестилуночную пластину и добавьте два миллилитра буфера для промывки на масло.

Отсасывайте супинат. Повторите эти шаги стирки еще два раза после последней стирки. Снимите крышку с колодца, используя мелкую заднюю часть.

Слейте лишнюю жидкость, окунув край крышки. Приложите его к бумажной салфетке. Поместите ячейку стороной крышки.

Спите на 25 микролитрах пола Alexa для восьми восьми вторичных антител против мыши на кусочек парфюма. После завершения инкубации инкубируйте в течение 45 минут во влажной камере при комнатной температуре, защищенной от света, переложите крышку сна на шестилуночную пластину и трижды промойте ячейки двумя миллилитрами промывочного буфера для каждой промывки после последней промывки. Снимите крышку с колодца и промойте один раз в ионизированной воде.

Слейте лишнюю жидкость, опустив на бумагу. Протрите крепление крышки и наклейте на светильник микроскопа восемью микролитрами мягкого монтажного раствора. Дайте монтажному раствору установить на ночь воздух на четыре градуса Цельсия.

Теперь образец готов к визуализации с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа. Нанесите небольшую каплю погружного масла на поверхность крышки сна и закрепите микроскоп. Слайд к столику для микроскопа.

Отрегулируйте предметный столик до тех пор, пока объектив микроскопа не соприкоснется с иммерсионным маслом. Чтобы получить яркое изображение, выключите окружающее освещение с помощью программного обеспечения Zes Zen. Нажмите на кран для прямого наблюдения за образцом через окуляр микроскопа.

Найдите заливку с ячейками и отрегулируйте фокус. Теперь переключитесь в режим сбора данных. Чтобы свести к минимуму перекрестные помехи между цветочными падениями, выберите отдельные дорожки для Alexa floor 4, 8, 8 и конечных четырех.

Красители и наборы для последовательного возбуждения и обнаружения. Отрегулируйте усиление и смещение мощности лазера, чтобы изображение не было переэкспонировано или недоэкспонировано. Сделайте снимок и проанализируйте интересующую область с помощью функции колокализации.

Коэффициент перекрытия может быть использован для оценки степени мечения вируса денге с помощью красителя Alexa Flo. Простой иммунофлуоресцентный анализ был проведен на вирусных клетках, и степень мечения может быть оценена по колокализации меченого вируса. С белком анти-е, эффективность окрашивания антиантител перекрывается в диапазоне от 0,65 до 0,8, что позволяет предположить, что примерно от 65 до 80% вариаций были помечены красителем Alexa floor. Чтобы процедура маркировки была успешной, важно подготовить буфер для маркировки и начать бушевать свежим способом, а также восстановить напольный дайджест Alexa перед маркировкой.

Концентрация используемого красителя может быть дополнительно оптимизирована в соответствии с вашими потребностями. Этот метод горизонтального мечения вируса денге потенциально может быть адаптирован для мечения других вирусов. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте с маркировкой.