Метилирования ДНК: Модификация бисульфита и анализа

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить возможность анализа метилирования ДНК динуклеотидов CPG путем геномного секвенирования сульфитной преобразованной ДНК. Это достигается путем предварительной денатурации двухцепочечной ДНК, чтобы могла произойти реакция превращения бисульфита. Второй шаг заключается в преобразовании всех неметилированных цитозинов в геномной ДНК в урацил путем дезаминирования бисульфитов.

Эта реакция включает в себя три фазы. Первый — сульфатация остатка цитозина путем добавления сульфита В к двойной связи пяти шести. Во-вторых, гидравлическое дезаминирование цитозина производным сульфита дает SSL производным сульфита, и, в-третьих, удаление сульфонатной группы щелочной обработкой приводит к образованию остатка SSL.

Затем целевой участок амплифицируют с помощью специфичных для бисульфитной конверсии праймеров и ПЦР-амплификации. Заключительным этапом является клонирование и секвенирование продукта ПЦР для получения однонуклеотидного разрешения для метилирования по всей молекуле ДНК. В конечном счете, результаты показывают метилирование ДНК динуклеотидов CPG в геномной ДНК за счет использования повышенной чувствительности цитокина по сравнению с пятью метилцитозином к дезаминированию бисульфата в кислых условиях.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как южный анализ крови, заключается в том, что он может обеспечить однонуклеотидное разрешение d-метилирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как роль метилирования ДНК в таких заболеваниях человека, как рак. Чтобы подготовить образцы ДНК для конверсии бисульфита, сначала инкубируют два микрограмма геномной ДНК с бисульфитом, буфером для лизиса ДНК и общим объемом 18 микролитров в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем денатурируйте геномную ДНК, добавив два микролитра свежеприготовленного трехмолярного гидроксида натрия до конечной концентрации 0,3 моляра. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут на водяной бане, после чего следует инкубация при температуре 90 градусов Цельсия в течение двух минут. В тепловом блоке немедленно поместите пробирки на лед на пять минут, центрифугируйте пробирки в течение от 10 секунд до 10 000 Gs, чтобы убедиться, что ДНК находится на дне пробирки, образцы денатурированной ДНК теперь готовы к дезаминированию в борьбе с В-клетками, которая будет продемонстрирована далее.

Перед реакциями сульфатации и гидролитического дезаминирования готовят свежие растворы 10 миллимолярного хинола и насыщенного мета натрия с рН сульфита 5,0. Поскольку метасульфит натрия представляет собой насыщенный раствор, небольшие комочки могут оставаться нерастворенными. Добавьте мета натрия по сульфиту 208 микролитров и хинол 12 микролитров в денатурационную ДНК 20 микролитров в конечном объеме 240 микролитров.

Сделайте пробирки вихревыми и центрифугируйте в течение 10 секунд, чтобы убедиться, что все капли находятся на дне пробирки. Нанесите на образцы минеральное масло. Инкубируйте образцы при температуре 55 градусов Цельсия на водяной бане в течение от четырех до 16 часов, в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей преобразованию.

Важно, чтобы преобразование бисульфита происходило в темное время суток, чтобы избежать окисления. По истечении соответствующего времени инкубации кратковременно прокрутите пробирки в микроцентрифуге, чтобы убедиться, что вся жидкость находится на дне пробирки. Затем осторожно выведите раствор ДНК со дна пробирки, не впитывая минеральное масло.

Для следующих шагов наша лаборатория использует систему очистки ДНК promega wizard. Добавьте один миллилитр смолы к образцам ДНК, переверните пробирку для перемешивания, затем налейте раствор пипеткой в шприц, прикрепленный к обессоливающей колонне. Наконец, чтобы удалить любые свободные ионы бисульфита, пропустите обработанную бисульфитом ДНК через обессоливающую колонну и добавьте 50 микролитров воды Milli Q.

Следующим этапом является удаление бисульфитного чердака с урацилового кольца путем опреснения. Для этого добавьте 5,5 микролитров свежеприготовленного трехмолярного гидроксида натрия в каждый образец ДНК, обработанный бисульфитом, до конечной концентрации 0,3 моляра. Затем инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Кратковременно центрифугируйте образцы, а затем добавьте по одному микролитру ТРНК в каждый образец. Нейтрализуйте раствор, добавив ацетат аммония до конечной концентрации в три моляра. Далее этанол осаждает ДНК.

Добавьте ледяной, 100% этанол 330 микролитров и хорошо перемешайте путем инверсии. Оставьте при температуре минус 20 градусов Цельсия на один час, чтобы центрифугировать на ночь при 14 000 GS в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите все следы надосадочной жидкости и высушите выпавшую ДНК на воздухе в течение примерно 20 минут.

После сушки на воздухе гранулу практически невозможно увидеть, повторно суспендируйте гранулу ДНК в 50 микролитрах 0,1 XTE или оставьте водой при комнатной температуре примерно на два часа, в течение этого времени время от времени поворачивайте трубки, чтобы убедиться, что ДНК растворена, после чего следует быстрая центрифуга. После того, как ДНК растворится, она может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия от одного до 10 лет, в зависимости от количества и качества ДНК, или быть использована немедленно. Для ПЦР-амплификации наиболее сложным аспектом этой процедуры является оптимизация праймера.

Таким образом, следующие рекомендации помогут обеспечить успешное проектирование грунтовки. Чтобы проиллюстрировать эти рекомендации, последовательность-мишень была преобразована сульфитом таким образом, что при записи преобразованные цитозины отображаются как синие Ts, а неконвертированные сайты CPG выглядят как красные cg. Праймеры должны иметь длину от 24 до 30 пар оснований для обеспечения специфичности. Грунтовки должны иметь аналогично прогнозируемую ТМ выше 50 градусов Цельсия и не отличаться более чем на один-два градуса Цельсия.

Праймеры должны содержать несколько оснований примерно от 25% C до T для обеспечения специфичности конверсии. Конечное основание, согласно которому три простых конца должны быть от C к T для обеспечения амплификации преобразованных D-N-A-C-P-G динуклеотидов, следует избегать в последовательности праймеров, чтобы избежать потенциального смещения в сторону метилированных неметилированных или неконвертированных матриц. Однако, если это неизбежно, цитозин в сайте CPG должен быть заменен на Y, чтобы обеспечить несмещенную амплификацию преобразованной ДНК.

Наконец, разработайте вложенные или полувложенные наборы праймеров для обеспечения специфичности или чувствительности ПЦР-реакции, если это необходимо. Приготовьте реакционные смеси ПЦР амплификации в 25 микролитрах аликвот для оптимизации. Каждая реакция содержит сульфитно преобразованную геномную ДНК, праймеры DPS, хлорид магния, хлорид калия, трис гидрохлорид, анак-полимеразу pH 8,3 для проверки на смещение амплификации метилированного или неметилированного материала.

Используйте 50 на 50 метилированный неметилированный полностью бисульфитный конверсионный контрольный образец для тестирования пропорциональной ПЦР-амплификации с бисульфитной конверсией. Специальные праймеры и реакционная смесь для ПЦР в термоамплификаторе с градиентом температуры устанавливают прогон реакции в градиенте плюс-минус три градуса Цельсия от ТМ праймера через восемь-10 пробирок, закручивают пробирки и кратковременно вращают в микроцентрифуге перед помещением их в термоамплификатор. На этом рисунке показан агрогель с профилем амплификации ПЦР с градиентом температуры из смеси 50% метилированной и неметилированной ДНК.

Ампликоны ПЦР и дорожки, отмеченные Т-полосами второй, пятой и восьмой, были обработаны ферментом рестрикции, который будет расщеплять только метилированную ДНК. Оптимальные условия амплификации ПЦР должны амплифицировать метилированные и неметилированные ампликоны пропорционально и без смещения, что приводит к равному количеству срезанного и неразрезанного продукта ПЦР, как показано здесь. Оптимальные условия термоциклирования для несмещенного усиления находятся на уровне 55,6 градусов Цельсия. Полная конверсия бисульфитной ДНК может быть проанализирована путем расщепления с помощью сайт-специфичного фермента цитозина, который будет переваривать только третью, шестую и девятую линии непреобразованной ДНК.

На полную конверсию бисульфитной ДНК здесь указывает отсутствие разрезанной ДНК на всех трех полосах: третьей, шестой и девятой. Этот график диссоциации в реальном времени показывает равную долю метилированной и неметилированной ДНК красной оранжевой линии 50 на 50 по сравнению с контрольной амплификацией полностью метилированной розовой линии m и неметилированной ДНК зеленой линии U, которые диссоциируют при 82,9 градусах Цельсия и 86,9 градусах Цельсия соответственно. Это указывает на то, что не существует смещения амплификации, основанного на температуре, при которой различные молекулы будут диссоциировать.

Полученные фрагменты ПЦР в результате амплификации образцов, обработанных бисульфитом, могут быть визуализированы с помощью гель-электрофореза и секвенированы. Непосредственно здесь показана трассировка последовательности из трех различных клеточных линий, в которых сайты CPG выделены желтым цветом: клеточная линия X демонстрирует 100% метилирование на всех трех сайтах CPG, где клеточные линии Y и Z демонстрируют различную степень метилирования, что видно по перекрывающимся сигналам GA, показанным здесь. На рисунке 4 A показана трассировка последовательности из трех различных клеточных линий, в которых сайты CPG выделены желтым цветом.

После прямого секвенирования отдельных клонов состояние метилирования отдельных молекул может быть сведено в таблицу в виде бисульфитной карты. Для визуализации метилирования гетерогенности плотность метилирования в отдельных сайтах CPG показана красным цветом. В этой репрезентативной карте бисульфитов высокопроизводительный количественный анализ метилирования образца.

С помощью технологии sequenome epi typer можно получить определенный спектр, зависящий от присутствия метилированных цитозинов, как показано в этом примере (рисунок 5 А. Сводка соотношений в образце может быть затем экстраполирована в виде эпиграммы на рисунке 5 В. В этом примере показан процент метилирования ДНК в каждом сайте CPG для четырех различных клеточных линий. Наконец, сводный график метилирования на рисунке 5 С может быть получен из эпиграммы После ее разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области эпигенетики к изучению метилирования ДНК и его роли в заболеваниях человека.