Метилирования ДНК: Модификация бисульфита и анализа

Общая цель данной процедуры — обеспечить анализ метилирования ДНК CpG-динуклеотидов путем геномного секвенирования ДНК, подвергнутой воздействию сульфита. Это достигается путем предварительной денатурации двухцепочечной ДНК для обеспечения протекания реакции бисульфитной конверсии. На втором этапе все неметилированные цитозины в геномной ДНК преобразуются в урацил посредством бисульфитного дезаминирования.

Эта реакция протекает в три фазы. Первая — сульфатирование остатка цитозина путем присоединения сульфита B к двойной связи между пятым и шестым атомами углерода. Во-вторых, гидролитическое дезаминирование цитозина производным сульфита приводит к образованию SSL с производным сульфита, и, в-третьих, удаление сульфонатной группы путем обработки щелочью приводит к образованию остатка SSL.

Затем целевой участок амплифицируют с использованием специфических праймеров для бисульфитной конверсии и методом ПЦР. Заключительным этапом является клонирование и секвенирование ПЦР-продукта для получения разрешения до одного нуклеотида при определении метилирования по всей молекуле ДНК. В конечном итоге результаты демонстрируют метилирование CpG-динуклеотидов в геномной ДНК за счет использования более высокой чувствительности цитозина по сравнению с 5-метилцитозином к бисульфитному дезаминированию в кислых условиях.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как саузерн-блот анализ крови, является возможность определения метилирования ДНК с разрешением до одного нуклеотида. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, например, о роли метилирования ДНК при заболеваниях человека, таких как рак. Для подготовки образцов ДНК к бисульфитной конверсии сначала инкубируйте 2 µg геномной ДНК с бисульфитом и буфером для лизиса ДНК до общего объема 18 µL в течение одного часа при 37 °C.

Затем денатурируйте геномную ДНК, добавив 2 µL свежеприготовленного 3 M гидроксида натрия до конечной концентрации 0,3 M. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 15 минут на водяной бане, затем инкубируйте при 90 °C в течение двух минут. Сразу после извлечения из термоблока поместите пробирки на лед на пять минут, центрифугируйте пробирки в течение 10 секунд при 10 000 G, чтобы осадить ДНК на дно пробирки; теперь денатурированные образцы ДНК готовы к деаминированию B-клеток, которое будет продемонстрировано далее.

Перед проведением реакций сульфатирования и гидролитической дезаминации приготовьте свежие растворы 10 мМ хинола и насыщенный раствор метабисульфита натрия при pH 5,0. Поскольку раствор метабисульфита натрия является насыщенным, в нем могут оставаться нерастворенные мелкие комочки. Добавьте 208 мкл метабисульфита натрия и 12 мкл хинола к 20 мкл денатурированной ДНК до достижения конечного объема 240 мкл.

Перемешайте содержимое пробирок на вортексе и центрифугируйте в течение 10 секунд, чтобы все капли осели на дно пробирки. Покройте образцы слоем минерального масла. Инкубируйте образцы при температуре 55 °C на водяной бане от 4 до 16 часов, в зависимости от количества и качества ДНК, подлежащей конверсии.

Важно, чтобы бисульфитная конверсия проходила в темноте во избежание окисления. По истечении соответствующего времени инкубации коротко центрифугируйте пробирки в микроцентрифуге, чтобы вся жидкость собралась на дне. Затем осторожно отпипетируйте раствор ДНК со дна пробирки, стараясь не захватить минеральное масло.

Для следующих этапов в нашей лаборатории используется система очистки ДНК Promega Wizard. Добавьте один миллилитр смолы к образцам ДНК, переверните пробирку для перемешивания, затем перенесите раствор пипеткой в шприц, подключенный к колонке для обессоливания. Наконец, чтобы удалить свободные ионы бисульфита, пропустите обработанную бисульфитом ДНК через колонку для обессоливания и растворите ее в 50 µL воды Milli Q.

Следующим шагом является удаление бисульфитного аддукта из кольца урацила путем десалирования. Для этого добавьте 5,5 µL свежеприготовленного 3 M гидроксида натрия в каждый образец ДНК, обработанной бисульфитом, до конечной концентрации 0,3 M. Затем инкубируйте образцы при 37 °C в течение 15 минут.

Кратковременно центрифугируйте образцы, затем добавьте по 1 µL TRNA в каждый образец. Нейтрализуйте раствор, добавив ацетат аммония до конечной концентрации 3 M. После этого осадите ДНК этанолом.

Добавьте 330 µL ледяного 100% этанола и тщательно перемешайте путем инверсии. Выдержите при температуре -20 °C от одного часа до ночи, затем центрифугируйте при 14 000 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C. После этого удалите все следы супернатанта и высушите осажденную ДНК на воздухе в течение примерно 20 минут.

После высушивания на воздухе осадок становится почти невидимым; ресуспендируйте осадок ДНК в 50 µL 0,1 XTE или воды и оставьте при комнатной температуре примерно на два часа. В течение этого времени периодически перемешивайте пробирки на вортексе, чтобы убедиться, что ДНК растворилась, после чего кратковременно центрифугируйте их. После растворения ДНК ее можно хранить при -20 °C от одного года до 10 лет, в зависимости от количества и качества ДНК, или использовать сразу. При проведении ПЦР-амплификации наиболее сложным аспектом данной процедуры является оптимизация праймеров.

Следовательно, ниже приведены рекомендации, которые помогут обеспечить успех при дизайне праймеров. Для иллюстрации этих рекомендаций целевая последовательность была подвергнута сульфитной конверсии, поэтому в записи конвертированные цитозины отображаются в виде синих T, а неконвертированные сайты CpG — в виде красных cg. Праймеры должны иметь длину от 24 до 30 пар оснований для обеспечения специфичности. Праймеры должны иметь схожую расчетную TM выше 50 °C и различаться не более чем на одну-две градуса Цельсия.

Праймеры должны содержать несколько оснований C, которые в среднем составляют около 25% от общего числа оснований, для обеспечения специфичности конверсии. Последним основанием на 3'-конце должен быть переход C в T, чтобы гарантировать амплификацию конвертированного ДНК. Следует избегать наличия динуклеотидов CpG в последовательности праймера, чтобы предотвратить возможный перекос в сторону метилированных, неметилированных или неконвертированных матриц. Однако, если это неизбежно, цитозин в сайте CpG следует заменить на Y, чтобы помочь обеспечить несмещенную амплификацию конвертированной ДНК.

Наконец, при необходимости разработайте наборы вложенных или полувложенных праймеров для обеспечения специфичности или чувствительности ПЦР-реакции. Подготовьте реакционные смеси для ПЦР-амплификации в аликвотах по 25 µL для оптимизации. Каждая реакция содержит сульфитно-конвертированную геномную ДНК, праймеры DPS, хлорид магния, хлорид калия, трис-гидрохлорид pH 8.3 и полимеразу для проверки смещения амплификации метилированного или неметилированного материала.

Используйте контрольный образец, состоящий из смеси 50% метилированной и неметилированной ДНК, подвергнутой полному бисульфитному превращению, для проверки пропорциональности ПЦР-амплификации при бисульфитной конверсии. С помощью специфических праймеров и реакционной смеси для ПЦР в термоциклере с температурным градиентом установите проведение реакции в градиенте плюс или минус 3 °C от TM праймера в 8–10 пробирках; перед помещением в термоциклер перемешайте содержимое пробирок на вортексе и кратковременно центрифугируйте в микроцентрифуге. На данном рисунке представлен электрофоретический гель с профилем ПЦР-амплификации с температурным градиентом для смеси 50% метилированной и неметилированной ДНК.

ПЦР-ампликоны в дорожках, отмеченных как T (дорожки две, пять и восемь), были обработаны рестрикционным ферментом, который расщепляет только метилированную ДНК. Оптимальные условия ПЦР-амплификации должны обеспечивать пропорциональное и непредвзятое амплифицирование метилированных и неметилированных ампликонов, что приводит к получению равного количества расщепленного и нерасщепленного ПЦР-продукта, как показано здесь. Оптимальные условия термоциклирования для непредвзятой амплификации составляют 55.6 °C. Полноту конверсии бисульфитной ДНК можно проанализировать путем расщепления цитозин-специфическим ферментом, который расщепляет только неконвертированную ДНК в дорожках три, шесть и девять.

Полная конверсия ДНК бисульфитом здесь подтверждается отсутствием расщепленной ДНК во всех трех дорожках: третьей, шестой и девятой. На данном графике диссоциации в реальном времени показана равная пропорция метилированной и неметилированной ДНК (красно-оранжевая линия, смесь 50:50) по сравнению с контрольной амплификацией полностью метилированной ДНК (розовая линия m) и неметилированной ДНК (зеленая линия U), которые диссоциируют при 82.9 °C и 86.9 °C соответственно. Это указывает на отсутствие систематической ошибки амплификации, основанной на температуре, при которой диссоциируют различные молекулы.

Полученные в результате ПЦР-амплификации фрагменты образцов, подвергнутых бисульфитной обработке, можно визуализировать с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенировать. Здесь непосредственно представлен профиль секвенирования трех различных клеточных линий с выделенными желтым цветом CpG-сайтами: клеточная линия X демонстрирует 100% метилирование во всех трех CpG-сайтах, в то время как клеточные линии Y и Z проявляют различную степень метилирования, что видно по перекрывающимся сигналам G и A. На рисунке 4А представлен профиль секвенирования трех различных клеточных линий с выделенными желтым цветом CpG-сайтами.

После прямого секвенирования отдельных клонов состояние метилирования отдельных молекул может быть представлено в виде таблицы на карте бисульфитного секвенирования. Для визуализации гетерогенности метилирования плотность метилирования в отдельных сайтах CpG отображается красным цветом. На данной репрезентативной карте бисульфитного секвенирования представлен высокопроизводительный количественный анализ метилирования образца.

Использование технологии sequenome epi typer позволяет получить специфический спектр, зависящий от наличия метилированных цитозинов, как показано на этом примере на рисунке 5А. Сводка соотношений в образце затем может быть экстраполирована в виде эпиграммы на рисунке 5Б. В данном примере показан процент метилирования ДНК в каждом сайте CpG для четырех различных клеточных линий. Наконец, после разработки эпиграммы можно получить график сводного анализа метилирования на рисунке 5В. Этот метод открыл исследователям в области эпигенетики путь к изучению метилирования ДНК и его роли в заболеваниях человека.