Стереотаксическая инъекция вируса для целенаправленного редактирования нейронных генов в мозге мыши

Закрепите мышь под наркозом в стереотаксической рамке.

Продезинфицируйте выбритую кожу головы, затем сделайте разрез по средней линии, чтобы обнажить череп.

Высушите череп и нанесите перекись водорода для улучшения видимости брегмы.

Найдите брегму и лямбду, а затем определите целевые участки.

Тщательно просверлите череп в целевых местах.

Приложите наполненный вирусом шприц к стереотаксическому инструменту.

Вирус кодирует Cas9 и единственную направляющую РНК для редактирования генома в зубчатых извилинах, а также флуоресцентный репортер для маркировки инфицированных нейронов.

Опустите шприц до зубчатой извилины, затем медленно вводите вирус, чтобы обеспечить равномерное распределение.

Постепенно поднимайте шприц и повторяйте инъекцию по дополнительным координатам.

Сделайте короткую паузу, чтобы предотвратить обратный поток, затем медленно извлеките иглу.

Повторите процедуру на противоположной полусфере.

Наконец, зашите разрез.

Теперь модель готова к дальнейшим исследованиям.

Побрейте голову мыши, находящейся под наркозом, чтобы подготовиться к месту инъекции. Направьте 4% изофлуран в носовой конус. Далее поместите мышь в стереотаксический инструмент. Вставьте прикусную планку в рот до тех пор, пока зубы не опустятся в прорезь, прежде чем закрепить ушные планки.

Убедитесь, что тело животного находится на грелке, а нос расположен в носовом конусе. Далее подтвердите анестезию, дав пощипывание ноги. Затем нанесите искусственные слезы для смазки глаз. Впоследствии промокните с бритой головы повидон-йодом и лидокаином.

Теперь сделайте небольшой разрез по средней линии кожи головы. Высушите череп тампоном и нанесите перекись водорода, чтобы помочь визуализировать брегму. С помощью препарирующего эндоскопа найдите брегму на черепе и поместите сверло над ней. Установите цифровые стереотаксические координаты плоскостей x, y и z равными 0.

Для того, чтобы убедиться, что головка выровнена по ростральной каудальной оси y, поместите сверло на лямбду и выровняйте головку так, чтобы z-координата была примерно равна 0 в брегме и лямбде. Чтобы убедиться, что головка выровнена по оси x, поместите сверло в среднюю точку между брегмой и лямбдой и измерьте z-координаты на расстоянии 1 миллиметра от средней точки с обеих сторон, чтобы убедиться, что они равны.

Затем опустите изофлуран до 2% перед тем, как поместить сверло над нужными координатами, и тщательно просверлите череп. Просверлив все отверстия, прикрепите шприц, наполненный вирусом, к стереотаксическому инструменту. Центрируйте шприц над отверстием и установите z-координату на черепе равным 0. Медленно опустите шприц на самую глубокую z-глубину и начните инъекцию со скоростью 0,25 микролитра в минуту с помощью стереотаксического инжектора.

После того, как инъекция будет завершена на самой большой z-глубине, подождите одну минуту, прежде чем поднимать ее до следующей координаты, и начните инъекцию снова. Продолжайте использовать этот шаблон до тех пор, пока не будут введены все координаты z-инъекции. После последней инъекции подождите две минуты, прежде чем извлекать шприц. Затем снимите мышь со стереотаксического инструмента и зашите кожу головы. Нанесите лидокаин и антибактериальный крем на область операции и введите обезболивающее лекарство перед переводом животного в отапливаемую камеру восстановления.