Одно отображение Судьба сотового у рыбок данио

Общая цель данного эксперимента заключается в том, чтобы выполнить картирование судьбы и прослеживание линии выбранных одиночных клеток в эмбрионах рыбок данио. Это достигается путем химической конъюгации флуоресцеина в клетке с высокомолекулярным декстраном. Затем подготовленный флюоресцеин в клетке вводятся в микроинъекции эмбрионов рыбок данио, которые затем фотоактивируются в выбранных клетках с помощью двухфотонной абсорбции.

После фотоактивации эмбрионов проводится иммуногистохимический анализ для обнаружения неизолированного флюоресцеина декстрана с целью составления карты судьбы активированных клеток. В конечном счете, этот метод может быть использован для определения линейного вклада и локализации в тканях фотоактивированных одиночных клеток. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как стандартная флуоресцентная микроскопия, заключается в том, что его можно использовать для дифференциального мечения отдельных клеток для картирования веры.

Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как как недифференцированные клетки-предшественники могут вносить свой вклад в различные типы тканей. Прежде чем начать, синтезируйте клетку флуоресцеина декстрана и храните его в пробирках, покрытых металлической фольгой. Затем микро-инъекции эмбрионов на одной-двухклеточной стадии с синтезированным клеточным флюоресцеином декстраном.

После того, как эмбрионы достигнут соответствующей стадии развития, очистите их от покрытия. Затем поместите покрытые оболочкой эмбрионы в легкоплавкие аэросовые фильтры для фотоактивации. Когда возникший застывший заряд LSM пять 10 программное обеспечение.

Поместите прозрачный желтый фильтр на пути белого луча света, а затем выберите «Сканировать новое изображение» и нажмите «Начать экспертный режим». Выберите вкладку «Лазер», включите аргоновый утюг и источники лазера mi tai. Установите длину волны mi tai на семь 40 нанометров.

Затем выберите вкладку конфигурации. Установите конфигурации оптического пути для иона аргонны и лазера mi tai. Затем выберите вкладку сканирования.

Измените цель на 20 умножить на 0,8. Установите максимальную скорость сканирования, щелкнув метод и число максимальной установки режима до среднего значения строки и единицы соответственно на вкладке каналов, отмените выбор всех лазерных источников, кроме mi tai. Затем поместите измеритель мощности на пути оптического луча, а затем нажмите кнопку con, чтобы активировать непрерывное сканирование.

Регулируйте процент пропускания до тех пор, пока измеритель мощности не покажет среднюю мощность лазера 47 милливатт. Затем остановите сканирование, нажав кнопку «Стоп» на вкладке «Каналы». Отмените выбор источника лазера mi tai и выберите аргонну.

Затем снова выберите быструю кнопку XY на вкладке каналов, отрегулируйте отверстие. Обнаружение усиления, усиление смещения и повторное усиление для лазера с аргоннским железом для достижения наилучшего качества изображения. С помощью контроллера сцены найдите ячейку для активации и сфокусируйтесь на ней, затем нажмите кнопку стоп С помощью инструмента обрезки обрезайте активированную ячейку так, чтобы коэффициент обрезки на вкладке режима отображался от 50 до 70.

Затем остановите сканирование, нажав кнопку «Стоп» на вкладке «Каналы». Снимите выбор аргонн-ионного лазера и выберите «Лазер My Tai» на вкладке «Режим». Установите скорость сканирования на 31,46 секунды.

Затем нажмите одну кнопку, чтобы начать сканирование двухфотонной активации клетки флуоресцентного декстрана выбранной клетки. После активации перейдите на вкладку «Каналы» и теперь снимите выбор с лазера mi tai и снова выберите лазер на ионах аргона. Затем в разделе mode установите коэффициент масштабирования равным единице. Следующий.

Под заголовком скорости нажмите кнопку max, чтобы установить самую высокую скорость сканирования. Чтобы просмотреть фотографию активированной области, выберите fast xy. Затем выберите вкладку каналов, отрегулируйте отверстие и снова определите, убедитесь, что область, активированная фотографией, не удалена лазером.

После подготовки фотографии активированные эмбрионы для иммунодетектирования флуоресцеином без клеток, следуя протоколу, изложенному в сопроводительной рукописи. Промойте эмбрионы шесть раз в PBT и два раза в буфере AP. Затем перенесите эмбрионы в девять луночных планшетов в буфере AP.

Далее аспирируйте буфер AP и добавьте N-B-T-B-C-I-P. Остановите появление красителя N-B-T-B-C-I-P путем аспирации раствора N-B-T-B-C-I-P. Затем промойте эмбрионы в PBT.

Теперь восстановите эмбрионы и встряхните их на вращающейся платформе в течение пяти минут комнатной температуры. Затем повторите промывку ПБТ еще два раза. Наконец, поместите эмбрионы в аросы с низким уровнем таяния 0,6% и получите изображения фотоактивированных клеток с помощью вертикального составного микроскопа.

На этом рисунке слева показано светлопольное изображение, а справа показано флуоресцентное изображение эмбриона рыбки данио, введенного микроинъекцией флуоресцеина dex перед фотоактивацией. Как показано на рисунке, эмбрион был фотоактивирован в одном из сомитов, обозначенных стрелкой в светлом поле слева, с длиной волны семь 40 нанометров, временем сканирования 31 секунда и средней мощностью лазера 47 милливатт. На рисунке справа после фото: на этом рисунке можно наблюдать флуоресценцию активации от неизолированного флюоресцеина декстрана.

Иммунное окрашивание незакрытого флуоресцеина декстрана изображается на небольшом участке в боковой пластинке, мезодерме размером 10. Таким образом, эмбрион стадии клеща был фотоактивирован с использованием тех же параметров лазера, что и на предыдущем рисунке, с помощью процедуры иммунодетекции. Активированная область, как указано здесь стрелкой, может быть идентифицирована с минимальным окрашиванием фона после этой процедуры.

Дополнительный анализ, такой как иммуноокрашивание на различные тканеспецифические маркеры, может быть выполнен для того, чтобы лучше охарактеризовать расположение и судьбу меченых клеток. Используя эту методику, исследователи в области сосудистой биологии прокладывают путь к изучению происхождения артериальных клеток в венозных прогениторах развивающихся эмбрионов рыбок данио. Не забывайте, что при работе с химическими реагентами, такими как NBT и BCIP, они могут быть чрезвычайно опасными, поэтому всегда следует надевать перчатки.