Структурирование эмбриональных стволовых клеток Использование Био Flip Chip
1 октября 2007 г.
Мы демонстрируем простой метод для размещения клеток в нужное место на подложке. Этот метод модели клетки, щелкая силиконовых чипов содержащие лунки заполнены клеток на подложке. Этот метод обеспечивает новый способ модуляции диффузии и juxtacrine сигналов между клетками.
Меня зовут Никель Митал. Я аспирант в лаборатории Боумена. Сегодня я расскажу об устройстве, разработанном двумя бывшими студентами нашей лаборатории, которое называется био-флип-чип (bio flip chip).
Данное устройство позволяет доставлять клетки на подложке по выбору экспериментатора в выбранной им конфигурации. Само устройство, один из экземпляров которого представлен здесь, устроено очень просто. По сути, оно состоит из крошечных лунок в силиконовой пластине.
Как правило, каждая лунка рассчитана на одну клетку, но при необходимости их можно сделать больше. Устройство изготавливается таким образом, чтобы расположение лунок соответствовало конечному расположению клеток на подложке. Таким образом, само устройство создается с помощью мягкой фотолитографии.
В частности, мы используем ПДМС (полидиметилсилоксан), который формуем на основе кремниевой пластины. Один из таких образцов представлен здесь. Сама пластина-форма изготавливается с помощью стандартной фотолитографии для нанесения рисунка на SU-8 фоторезист, который наносится на кремниевую пластину методом центрифугирования.
Таким образом, вкратце, перенос клеток на выбранный субстрат осуществляется путем заполнения лунок био-флип-чипа этими клетками. Затем чип прикладывают к выбранному субстрату, которым часто служит культуральный полистирол. И, наконец, всю конструкцию переворачивают, позволяя клеткам переместиться из лунок на субстрат.
Меня зовут Стефани Флавин. Я студентка-исследователь в лаборатории Голдмана, и сегодня я продемонстрирую, как использовать био-флип-чип для паттернирования клеток за день до начала основного эксперимента по созданию клеточных структур.
Мы закрепим PDMS на стеклянном предметном стекле размером один на один дюйм с помощью плазменной склейки. Затем мы замочим чип на ночь стороной со скважинами вниз в растворе PBS. Также мы вырежем прокладки для использования в эксперименте по созданию паттернов и подготовим зажимы-биндеры.
Нанесите 200 µL BSA на поверхность каждого чипа. Аккуратно перемешайте раствор на поверхности чипа кончиком пипетки, чтобы удалить пузырьки воздуха и заполнить лунки раствором BSA. Оставьте чипы под вытяжным шкафом на один час в камере с УФ-облучением, как обычно.
Через один час аспирируйте раствор BSA с чипов и промойте каждый чип 200 µL PBS, затем нанесите 200 µL суспензии клеток пассажа с плотностью 10⁶ клеток/мл. После выдержки в течение 5–10 минут для оседания клеток в лунки промойте поверхность чипа раствором PBS. Наклоните чип одним углом под углом примерно 15° и медленно удалите суспензию клеток пипеткой из нижнего угла чипа.
Верните чип в горизонтальное положение и медленно добавьте 50 µL PBS в верхний угол. Повторяйте стадию промывки столько раз, сколько потребуется. После того как xls будут удалены с поверхности чипа, добавьте примерно 50 µL среды во внутреннюю прокладку чашки.
Добавьте среду на поверхность каждого чипа. Затем переверните чашку, наклоните ее и опустите на поверхность чипа, начиная с одного угла. После этого плотно прижмите чашку к чипу, чтобы избежать образования пузырьков воздуха между ними.
Закрепите чип с обеих сторон с помощью биндерных зажимов. Снимите ручки с каждого зажима, чтобы при переворачивании чип лежал на чашке ровно. Перенесите чип в инкубатор и быстро переверните его, избегая любых лишних движений.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод позиционирования клеток на подложке с использованием устройства, называемого био-флип-чипом. Переворачивая силиконовый чип с микролунками, заполненными клетками, на подложку, исследователи могут эффективно контролировать расположение клеток, что улучшает модуляцию сигналинга между ними.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Нейробиология
- Биоинженерия
Теоретическая часть
- Точное позиционирование клеток имеет решающее значение для изучения клеточных взаимодействий.
- Современным методам может не хватать точности при размещении клеток.
- Био-флип-чип (bio flip chip) представляет собой простое и эффективное решение.
- Данный метод может влиять как на диффузную, так и на юкстакринную передачу сигналов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод размещения клеток на подложках.
- Углубить понимание механизмов клеточной сигнализации.
- Предоставить инструмент для исследователей в различных областях биологии.
Используемые методы
- Проектирование и изготовление био-флип-чипа.
- Заполнение микролунок клетками.
- Переворачивание чипа на выбранную подложку.
- Наблюдение и анализ расположения клеток и их сигналинга.
Основные результаты
- Успешное размещение клеток в заданных локациях.
- Улучшенная модуляция клеточной сигнализации.
- Демонстрация простоты использования устройства.
- Потенциальное применение в различных экспериментальных установках.
Выводы
- Био-флипчип представляет собой инновационный инструмент для размещения клеток.
- Данный метод может оказать существенное влияние на исследования клеточной сигнализации.
- Будущие исследования могут расширить применение этой методики для более широкого спектра задач.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точный пространственный контроль популяций клеток позволяет детально изучить механизмы диффузных и юкстакринных сигнальных путей, что имеет решающее значение для валидации мишеней в моделях заболеваний на основе стволовых клеток. Система Bio Flip Chip представляет собой независимый от типа подложки и сохраняющий химический состав метод формирования заданных клеточных микроокружений, что обеспечивает воспроизводимую разработку анализов для фенотипического скрининга. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет снижения вариативности межклеточных контактов и воздействия паракринных факторов, тем самым улучшая трансляционную преемственность при переходе от моделей in vitro к доклинической валидации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить гипотезы о том, как локальная плотность клеток и их пространственное расположение влияют на пути дифференцировки и самообновления стволовых клеток.
- Практическая ценность: исключает стохастическую вариабельность, возникающую при случайном посеве, обеспечивая стабильность юкстакринных и паракринных сигнальных воздействий в повторностях.
- Прогностическая ценность: способствует механистическому снижению рисков путем изоляции вклада контактно-зависимой сигнализации по сравнению с растворимой в исследованиях взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать количественно определяемые, пространственно ограниченные массивы клеток, совместимые с высокопроизводительной визуализацией и мультиплексным считыванием данных.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию анализов межклеточного взаимодействия на полистироле для культур тканей, стекле, Matrigel и фидерных слоях без изменения химического состава подложки.
- Масштабируемость: совместимость с методом микроконтактной печати для создания паттернов внеклеточного матрикса, что позволяет осуществлять комбинаторный контроль сигналов адгезии и сигнализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: создание паттернов эмбриональных стволовых клеток в определенных нишах для моделирования путей сигнальных взаимодействий развития, имеющих значение для врожденных заболеваний и регенеративной медицины.
- Доклиническое моделирование: облегчает анализ зависимости «доза-ответ» для морфогенов или терапевтических средств в пространственно контролируемых микросредах, что повышает физиологическую релевантность.
- Прогресс с учетом рисков: снижает количество ложноположительных результатов при идентификации перспективных соединений за счет минимизации шума, вызванного неконтролируемой агрегацией клеток или вариативностью частоты контактов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Bio Flip Chip интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем обеспечения воспроизводимого паттернирования стволовых клеток перед воздействием соединений, что позволяет проводить скрининг на основе гипотез и изучение механизмов в процессе оптимизации ведущих соединений.
- Открывательная биология: позволяет изучить, как определенная пространственная организация эмбриональных стволовых клеток модулирует спецификацию клеточных линий и активность сигнальных путей.
- Скрининг: обеспечивает создание стандартизированных, воспроизводимых клеточных субстратов для оценки влияния соединений на контактно-зависимую и диффузную передачу сигналов.
- Аналитика: позволяет проводить количественное пространственное картирование экспрессии маркеров, пролиферации и апоптоза в качестве зависимых переменных в структурированных кокультурах.
- Трансляционные исследования: моделирует каскады сигнальных путей развития человека в пространственно контролируемых системах для обоснования выбора мишеней на доклиническом этапе.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как модульная платформа для структурирования, адаптируемая к различным типам клеток, субстратам и конфигурациям внеклеточного матрикса в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишеней за счет снижения биологического шума, вызванного неконтролируемыми взаимодействиями между клетками.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость анализа благодаря точному, определяемому пользователем расположению клеток, независимо от вариабельности метода посева.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет улучшения соотношения сигнал/шум в фенотипических скринингах, направленных на изучение межклеточных коммуникаций.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию модуляторов юкстакринных путей (например, Notch, Wnt) с учетом рисков в областях заболеваний, связанных со стволовыми клетками.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области мягкой литографии и работы с PDMS для изготовления или приобретения чипов.
- Зависит от наличия оборудования для плазменного бондинга и УФ/озоновой обработки для подготовки подложки.
- Необходимы стандартизированные протоколы подготовки и промывки клеток для обеспечения эффективного заполнения и высвобождения из лунок.
- Адаптация к 3D-матрицам или микрофлюидным системам может потребовать оптимизации времени переворота и поверхностной энергии.
- Практическое ограничение: степень заполнения лунок должна быть определена эмпирически для каждого типа и размера клеток, чтобы избежать попадания нескольких клеток в лунки, предназначенные для одной клетки.
