Cut-загрузки: полезный инструмент для изучения Протяженность Gap Муфта Tracer стыке нейронов сетчатки

Общей целью следующего эксперимента с нагрузкой на разрез является изучение степени связи между нейронами в интактной сетчатке в условиях контролируемого освещения. Первый шаг достигается путем разрезания сетчатки острым лезвием, смоченным в растворе нейробиотина, молекулы-индикатора, которая может диффундировать через открытые каналы соединения, но не через клеточные мембраны. На втором этапе сетчатка инкубируется в растворе Рингера, который обеспечивает диффузию индикатора через каналы соединения с открытой щелью.

Если связь с щелевым соединением слабая, флуоресценция нейробиотина будет ограничена нейронами сетчатки, которые находятся рядом с разрезом. Напротив, если связь щелевого перехода сильна, флуоресценция будет обнаружена в нейронах сетчатки, расположенных далеко от разреза. Основное преимущество нагрузки на разрез перед существующими методиками заключается в том, что ее легче выполнять на нейронах с маленькими клеточными тельцами в неповрежденной нервной ткани сетчатки.

Кроме того, легче контролировать условия освещения во время резаной нагрузки, чем при электрофизиологическом исследовании отдельных нейронов в неповрежденной ткани сетчатки. Поскольку световые стимулы, используемые во время электрической записи, сами по себе могут привести к изменениям в связи с зазорным переходом, демонстрировать эту технику будет доктор Чу Чой, постдок из моей лаборатории. При этой процедуре золотая рыбка содержится в постоянной темноте днем не менее одного часа перед операцией, а все следующие шаги до фиксации ткани сетчатки, также выполняются в течение дня в постоянной темноте, глубоко обезболивают золотых рыбок путем добавления 150 миллиграммов на литр сульфоната метана в аквариумную воду.

Затем принесите золотую рыбку в жертву в соответствии с федеральными и университетскими рекомендациями и осторожно удалите ее глазные яблоки. Затем удалите переднюю часть каждого глазного яблока. Затем положите лист фильтровальной бумаги поверх задней части глаза и переверните фильтровальную бумагу и глаз так, чтобы фильтровальная бумага оказалась под задней частью глаза.

Теперь аккуратно удалите заднюю часть глаза, включая склеры и пигментный эпителий у темных адаптированных золотых рыбок. Сетчатку разрежьте зрительный нерв с помощью тонких ножниц. Нервная золотая рыбка, ориентированный на сетчатку фоторецептор вверх, теперь должна быть прикреплена к фильтровальной бумаге перед энуклеацией, в то время как рыба подвергается анестезии в пяти миллилитрах, насыщенной кислородом раствора Рингера на основе карбоната, с испытуемым препаратом или без него, в каждую лунку шестилуночной пластины после рассечения интактной нервной сетчатки из задней части глаза.

Перенесите сетчатку в лунки в постоянной темноте. Затем запечатайте лунки параформой и дайте ткани поинкубироваться в течение 30 минут. Приготовьте 100 микролитров раствора индикатора, растворив 0,5% нейробиотина в растворе Рингера непосредственно перед разрезанием сетчатки.

Далее добавьте раствор нейробиотина в стеклянную чашку Петри. Затем аккуратно постучите по фильтровальной бумаге, к которой прикреплена сетчатка глаза, по бумажному полотенцу. Чтобы удалить излишки звона, окуните лезвие бритвы в раствор нейробиотина и сделайте перпендикулярный радиальный надрез через сетчатку глаза и фильтровальную бумагу.

После этого снова окуните лезвие бритвы в раствор нейробиотина и разрежьте сетчатку глаза второй раз. Повторите это до четырех надрезов на сетчатке. На этом этапе перенесите сетчатку на свежие звонки, среду с испытуемым препаратом или без него на 15 минут, чтобы обеспечить загрузку и диффузию.

Промыть его три раза свежими кольцами, средними с исследуемым препаратом или без него в течение пяти минут каждый. Затем зафиксируйте сетчатку с помощью 4%-ного параформальдегида в буферном растворе 0,1 молярного фосфата при комнатной температуре на один час. Впоследствии промойте сетчатку 0,1 моляром PBS на ночь при четырех градусах Цельсия, поместив ее в холодильник на следующий день.

Реакцию на сетчатку с 2%-ным стрептавидином Alexa 4 88 в 0,1 молярного PBS и 0,3%-ным тритоном X 100 до конечной концентрации 10 мкг/миллилитр и инкубировали в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день. Трижды промойте сетчатку 0,1 моляра PBS при комнатной температуре каждый раз в течение 10 минут.

Отсоедините сетчатку от фильтровальной бумаги в PBS. Затем с помощью тонкой кисти закрепите фоторецептор сетчатки стороной вверх на предметном стекле с помощью монтажной среды Vector Shield. Перенесите предметное стекло в лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и сделайте снимки с одинаковым разрешением увеличения и настройками для каждого экспериментального условия, чтобы можно было провести сравнение влияния различных экспериментальных условий на степень функциональной связи индикатора с зазором.

Вот степень связи фоторецепторных клеток в течение дня в постоянной темноте по сравнению с днем в постоянной темноте в присутствии одного селективного антагониста дофаминового D-2 рецептора. Обратите внимание, что порез бритвой на обоих изображениях находится слева. Хотя одно изображение может содержать все помеченные ячейки, рекомендуется собрать стек Z области интереса и свернуть его в одно показанное изображение.

Вот степень связи фоторецепторных клеток при последовательном движении через такой Зак. Обратите внимание, что порез бритвой на этом изображении находится справа. Чтобы количественно оценить степень связи трассеров в браузере изображений LSM, откройте изображение, затем нажмите кнопку «Экспорт» и сохраните изображение, поскольку несжатая файловая масштабная линейка TIF 16 бит должна быть включена в это изображение TIFF с помощью программного обеспечения NIH image J.

Измерьте интенсивность флуоресценции меченого нейробиотина Alexa 4 88 по изображениям сетчатки с отверстием при малом увеличении. Откройте файл TIFF с помощью программы Image J и нарисуйте прямую линию, соответствующую масштабной линейке. Далее переходим к анализу, устанавливаем масштаб и вводим известное расстояние и единицу длины.

Затем нажмите OK. Теперь измерения флуоресценции могут быть представлены в калиброванных единицах, таких как миллиметры. После этого выделите область интереса с помощью инструмента прямоугольного выделения.

Пик флуоресцентного излучения должен быть расположен на левой границе выделенного цвета. Убедитесь, что рядом с правой границей нет флуоресцентного сигнала. Нажмите кнопку «Анализ» и построите профиль для данных дневного управления, полученных в постоянной темноте.

Кривая с экспоненциальным затуханием отображается слева направо. Затем нажмите «Копировать» во всплывающем окне и вставьте его в Excel. Теперь есть два столбца, один из которых показывает расстояние от разреза, а другой показывает интенсивность флуоресценции в зависимости от расстояния от разреза.

В качестве сравнения вышеуказанные шаги повторяются с данными, полученными в постоянной темноте днем. В присутствии слюны бро разделите каждое исходное значение флуоресценции на максимальное значение флуоресценции, чтобы получить относительную интенсивность флуоресценции. Скопируйте два столбца, соответствующих расстоянию от разреза и относительной интенсивности флуоресценции, а затем вставьте их в исходное программное обеспечение.

Эти шаги показаны как для дневного контроля, так и для дневной косы. Данные запуска в этой точке совпадают с результатами с экспоненциальным затуханием. Функция номер один, сравнение значений пространственной постоянной в различных экспериментальных условиях с помощью Т-критерия или Иновы.

Для сравнения показаны экспоненциальные функции и статистический анализ данных дневного управления, дневного пип-рона и ночного управления. Показывать. Вот примеры степени связи фоторецепторных клеток в темноте адаптированной сетчатки золотой рыбки днем А, ночью В и днем в присутствии одного селективного антагониста дофаминовых D-двух рецепторов, как было выявлено с помощью техники разрезанной загрузки. Все конфокальные изображения были получены с использованием одних и тех же настроек для сравнения.

На этом графике интенсивность флуоресценции для трех экспериментальных условий построена в зависимости от расстояния от разреза и аппроксимирована экспоненциальной функцией. Метод нагружения в разрезе используется для количественной оценки степени контактной связи с зазором путем вычисления значений пространственной постоянной, как показано здесь для трех экспериментальных условий. Техника разрезанной нагрузки также может быть использована для исследования электрических синапсов между другими типами клеток сетчатки и у других видов.

Например, эти два рисунка иллюстрируют, что горизонтальные клетки кролика, типа А и В демонстрируют гомологичное следование за трассирующим соединением, разрезающую нагрузку и диффузию нейробиотина в условиях адаптации к темноте. Мы использовали метод нагружения разреза для изучения степени диффузии индикатора через щелевые соединения между стержнями и конусами днем и ночью. Кроме того, этот метод может быть использован для определения того, контролируется ли трассерная связь между другими нейронами сетчатки часами сетчатки и/или определенными условиями светлой темноты.

Он также может быть использован для изучения трассерной связи между нейронами в других областях мозга.