Интраназальная доставка миРНК в мозг мыши с помощью позиционирующего устройства

Начните с мышей под наркозом, помещенных на позиционирующее устройство спиной параллельно опоре спинки стула и перпендикулярно сиденью.

Мыши располагаются в положении «голова вниз и вперед» и фиксируются с помощью ремней стула.

С помощью микропипетки, наполненной комплексом пептид-миРНК, нацеленным на нейроны, поместите каплю возле одной ноздри, позволяя мыши вдыхать раствор естественным образом.

Осторожно надавливайте на голову мыши вниз во время вдоха, чтобы раствор не попал в легкие.

Сделайте короткую паузу, затем повторите введение в другую ноздрю.

Повторите процедуру для оставшихся мышей.

Комплекс проникает в слизистую оболочку носа, откуда поступает в обонятельный и тройничный нервы и путешествует по ним, чтобы добраться до мозга.

Внутри мозга комплекс связывается с нейрональными рецепторами, подвергается эндоцитозу и способствует внутриклеточной доставке миРНК.

МиРНК становится частью комплекса RISC, который, связываясь с мРНК-мишенью, индуцирует сайленсинг генов.

Чтобы начать эту процедуру, оцените уровень анестезии двуногого рефлекса мышей с целью поддержания операционной плоскости. Затем разместите позиционирующее устройство на соответствующем расстоянии и высоте, чтобы обеспечить удобный доступ ко всем необходимым реагентам.

Затем нанесите мазь на глаза животного. Пристегните одну мышь ремнями стула, убедившись, что передние конечности мыши обеспечивают естественную поддержку, когда она находится в расслабленном положении без какого-либо дискомфорта. Повторите процедуры для оставшихся мышей. Аккуратно поместите каждую мышь на обозначенный стул, положив ее спинку параллельно опоре спинки стула и под углом 90 градусов к сиденью стула.

Позвольте животному естественно лежать в положении головой вниз и вперед, не толкая и не давя. Как только все мыши будут привязаны, немедленно начните интраназальную инокуляцию. Чтобы выполнить интраназальное введение, загрузите в микропипетку 2 микролитра комплексного раствора RVG9R-siRNA. Держите пипетку в доминирующей руке, а другой рукой поддерживайте ее, чтобы избежать неконтролируемых движений во время введения миРНК.

Поместите каплю объемом 2 микролитра очень близко к одной ноздре, чтобы мышь могла непосредственно ее вдохнуть. Если крошечная капля образуется нелегко, замените наконечник пипетки на новый и повторите операцию. На вдохе указательным пальцем слегка опустите головку мыши вниз в течение 5 секунд и сохраняйте положение.

Чтобы предотвратить отток препарата в легкие, важно слегка надавливать указательным пальцем вниз на голову мыши в течение 5 секунд, пока мышь делает вдох.

Запустите секундомер, чтобы отсчитывать время через три-четыре минуты после этого, чтобы засечь время прививки во вторую лапу первой мыши. Этот временной интервал необходим для того, чтобы мышь завершила ингаляцию первой дозы и восстановила нормальное дыхание. В трех-четырехминутном интервале между инокуляцией альтернативных ноздрей у первой мыши должна быть проведена полная интраназальная инокуляция одной ноздри у каждой из оставшихся трех мышей, помещенных на устройство.

Когда прозвучит секундомер, сделайте прививку второй ноздре на первой мыши и повторите процедуру для других мышей, как описано выше. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет введено от 20 до 30 микролитров для всех четырех мышей. На завершение всей процедуры инокуляции уйдет от 30 до 45 минут. Верните животных обратно в предназначенные для этого клетки. Не оставляйте мышей без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной.