Выделение и очистка рекомбинантных гликопротеинов миелина олигодендроцитов
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:59 мин • August 7th, 2025
MOGtag представляет собой рекомбинантный гликопротеин миелина олигодендроцитов, слитый с метками солюбилизации и очистки для экспериментальных исследований аутоиммунного энцефаломиелита.
Чтобы изолировать MOGtag, суспензируйте бактериальные клетки, экспрессирующие MOGtag, в буфере для лизиса и инкубируйте.
Ферменты и детергенты в буфере разрушают липиды мембраны и разрушают клеточную стенку.
Ультразвуком для дальнейшей лизиации клеток, высвобождая нерастворимые тела включений, содержащие MOGtag.
Центрифуга для гранулирования включенных тел. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в буфере и инкубируйте.
Добавьте гидрохлорид гуанидина, затем инкубируйте для растворения MOGtag.
Перенесите растворимые белки на заряженную никелевую смолу, перемешайте и инкубируйте с встряхиванием, чтобы MOGtag смог соединиться с ионами никеля.
Центрифуга для гранулирования связанного MOGtag. Извлеките надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в элюирующем буфере и инкубируйте с встряхиванием.
Имидазол в буфере элюирования высвобождает MOGtag из смолы.
Снова центрифугируйте, соберите очищенный надосадочный ток, содержащий MOGtag, и сохраните его для дальнейшего анализа.
Равномерно распределите культуры по 250 миллилитровым бутылкам, совместимым с высокоскоростным центрифугированием, и с этого момента держите бутылки на льду. Гранулируйте бактериальные клетки при концентрации 22 000 г в течение 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Повторно суспендируйте и смешайте все бактериальные гранулы в общей сложности 30 миллилитров буфера для лизиса. Перенесите этот объем в круглое дно 50-миллилитровой пробирки, способной к высокоскоростному центрифугированию.
Поместите эту трубку на водяную баню с температурой 30 градусов Цельсия на 30 минут. Во время инкубации дважды встряхните трубку, чтобы вернуть клетки на суспендию. После инкубации перенесите трубку на лед и обработайте раствор ультразвуком с частотой 20 килогерц и амплитудой 70%, пульсируя в течение трех секунд и выключая в течение трех секунд в течение 5 импульсов. Обрабатывайте раствор ультразвуком в течение шести раундов по пять импульсов, позволяя раствору охлаждаться на льду между раундами.
Далее центрифугируют раствор при температуре 24 000*г в течение 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия, затем повторно суспендируют гранулу в 30 миллилитрах буфера А и инкубируют раствор при температуре 4 градуса Цельсия в течение трех часов. Затем добавьте в раствор 17,2 грамма гуанидин-гидрохлорида. Инкубируйте образец на льду в течение одного часа, чтобы растворить белок MOG-метки. Чтобы очистить белок MOG-метки, перенесите весь объем солюбилизированного белка в первую пробирку, содержащую никелевую смолу. После смешивания поместите трубку горизонтально на коромысло при температуре 4 градуса Цельсия на один час.
После центрифугирования пробирки при температуре 4500*g в течение восьми минут при 4 градусах Цельсия перенесите надосадочную жидкость во вторую пробирку с никелевой смолой и инкубируйте как раньше. Тем временем ресуспендируйте никелевую смолу в первой пробирке в 40 миллилитров элюирующего буфера и поместите пробирку горизонтально на коромысло при температуре 4 градуса Цельсия на пять минут перед центрифугированием, как раньше. Перелейте надосадочную жидкость, содержащую элюированный белок MOG-метки, в бутылку объемом 250 миллилитров с маркированным очищенным белком MOG-меткой. Держите эту бутылку при температуре 4 градуса по Цельсию.
Обзор
В данной статье подробно описан процесс очистки MOGtag — рекомбинантного миелинового олигодендроцитарного гликопротеина, необходимого для исследований экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Методология включает бактериальный лизис, солюбилизацию и методы очистки для выделения MOGtag с целью дальнейшего анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Очистка белков
- Исследования аутоиммунных заболеваний
Теоретическая часть
- MOGtag имеет решающее значение для изучения аутоиммунных заболеваний, связанных с миелином.
- Понимание процесса его очистки способствует воспроизводимости экспериментов.
- Процесс включает в себя различные биохимические методы.
- Исследования MOGtag расширяют представление о демиелинизирующих состояниях.
Цель исследования
- Разработать надежный метод выделения MOGtag.
- Углубить понимание миелинового олигодендроцитарного гликопротеина в исследованиях.
- Предоставить протокол, который может быть воспроизведен в других лабораториях.
Используемые методы
- Суспендирование бактериальных клеток в лизирующем буфере.
- Соникация для лизиса клеток и высвобождения телец включения.
- Центрифугирование для выделения осадков, содержащих MOGtag.
- Использование никелевого сорбента для связывания и очистки белка.
Основные результаты
- Успешное выделение MOGtag из бактериальных клеток.
- Достижение высокой степени чистоты MOGtag в результате процессов элюции.
- Протокол продемонстрировал воспроизводимость в ходе серии опытов.
- Очищенный MOGtag сохранен для дальнейшего использования в экспериментах.
Выводы
- Описанный метод эффективен для очистки MOGtag.
- Полученные результаты обосновывают дальнейшие исследования аутоиммунного энцефаломиелита.
- Данный протокол может быть полезен при изучении заболеваний, связанных с миелином.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Очистка рекомбинантного MOGtag позволяет стандартизировать производство антигенов, имеющих значение для изучения заболеваний, для исследований аутоиммунной демиелинизации. Надежный доступ к очищенному MOGtag способствует снижению механистических рисков и валидации мишеней в доклинических моделях рассеянного склероза. Эта возможность обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до валидации in vivo в рамках исследовательских циклов по аутоиммунной нейробиологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать B-клеточное опосредованное аутоиммунитет с использованием определенных рекомбинантных антигенов.
- Обеспечивает функциональную валидацию иммунных ответов, направленных на миелин, в моделях заболеваний.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет предоставления стабильного антигенного материала для проверки гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение воспроизводимого очищенного белка для стандартизации анализа и последующих этапов скрининга.
- Позволяет проводить количественную оценку иммунных ответов в валидированных биологических системах.
- Обеспечивает масштабируемость и возможность повторного использования на различных экспериментальных платформах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, релевантным для трансляционного поиска биомаркеров в нейроиммунологии.
- Обеспечивает непрерывность процесса от производства антигенов до исследований эффективности in vivo и изучения механизмов действия.
- Снижает биологическую вариабельность в доклинических исследованиях аутоиммунного энцефаломиелита.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Протокол очистки MOGtag применяется на стыке производства антигенов и разработки доклинических моделей, обеспечивая рабочие процессы от начального этапа поиска до трансляционной валидации.
- Фундаментальная биология: обеспечивает получение высококачественного антигена для исследований иммунного ответа на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: позволяет осуществлять воспроизводимую разработку методов анализа и количественное иммунное профилирование.
- Аналитика: предоставляет очищенный белок для последующих биохимических и иммунологических анализов.
- Трансляционные исследования: связывает производство антигенов с валидацией на моделях in vivo для согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: стандартизированный протокол обеспечивает воспроизводимость результатов между различными исследованиями и командами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней аутоиммунных заболеваний и в механистических исследованиях.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированную и масштабируемую очистку белков для получения стабильных результатов экспериментов.
- Стратегическая ценность: Снижает биологические риски на поздних этапах за счет обеспечения качества и воспроизводимости антигенов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять продвижение активов и моделей в области нейроиммунологии с учетом скорректированных рисков.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт работы с процессами экспрессии и очистки рекомбинантных белков.
- Необходим доступ к оборудованию для высокоскоростного центрифугирования, соникации и аффинной хроматографии.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Может потребоваться адаптация метода для различных конструкций антигенов или систем экспрессии.
- Выход и растворимость белка могут варьироваться в зависимости от условий экспрессии и дизайна конструкции.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Получение Крыса олигодендроцитов предшественники культур и Количественная оценка Oligodendrogenesis Использование двойного инфракрасного флуоресцентного Сканирование
Похожие видео
0 Просмотры
Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Поколение олигодендроцитов и олигодендроцитов-кондиционированных средних для совместно-культурных экспериментов
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение микроглии из коры головного мозга взрослой мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и культивирование клеток-предшественников олигодендроцитов из коры головного мозга детенышей мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение первичных олигодендроцитов мышей с помощью иммуномагнитных шариков
Похожие видео
0 Просмотры
Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для In Vitro миелинизации Анализы
Похожие видео
0 Просмотры
Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований
Похожие видео
0 Просмотры
Рассечение и выделение мышиной глии из нескольких областей центральной нервной системы
Похожие видео
0 Просмотры
Одновременное выделение основных типов клеток резидентных клеток центральной нервной системы у взрослых мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026