Hyperinsulinemic-euglycemic Зажимы в сознании, Безудержная Мыши

Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке действия инсулина на весь организм и отдельные ткани у бодрствующих мышей, не подвергающихся стрессу, без необходимости их ручного захвата. Это достигается путем хирургической имплантации катетера в яремную вену для инфузий и другого катетера в сонную артерию для забора проб крови. После периода восстановления продолжительностью от пяти до семи дней мышам, находившимся на голодном пае в течение пяти часов, вводят инсулин для достижения физиологической гиперинсулинемии.

Затем извлекают кровь из артериального катетера для измерения уровня глюкозы, и поддерживают уровень гликемии путем регулирования скорости инфузии глюкозы. Данный эксперимент позволяет определить различия в чувствительности всего организма к инсулину, основываясь на прямой зависимости между скоростью инфузии глюкозы, необходимой для поддержания гликемии, и действием инсулина. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими способами забора крови, такими как сечение хвоста, является то, что хирургически имплантированный артериальный катетер обеспечивает сосудистый доступ к мыши, что позволяет получать образцы крови без необходимости манипуляций с животным.

Это позволяет нам проводить данные эксперименты на мышах, находящихся в состоянии покоя и без ограничений в движении. Артериальный катетер изготавливают путем вставки скошенного фрагмента трубки PE 10 в шестисантиметровый фрагмент трубки astic таким образом, чтобы трубка PE 10 выступала на 0,9 сантиметра из SEL. Венозный катетер представляет собой шестисантиметровый фрагмент трубки SEL с воротничком.

Массу создают, вставляя трехсантиметровые отрезки PE 20 в каждый из двух 1,3-сантиметровых коннекторов из нержавеющей стали 25-го калибра (Ben) под углом примерно 120 градусов. Их помещают в каплю медицинского силиконового адгезива, как показано здесь. Чтобы начать имплантацию катетера, поместите анестезированную мышь на чистую рабочую поверхность, используя стерильную технику. Сделайте разрез в пяти миллиметрах справа от средней линии.

Изолируйте правую яремную вену. Осторожно перевяжите головной конец шелковой нитью и неплотно завяжите другой фрагмент нити на каудальном конце. Затем сделайте разрез чуть ниже головной лигатуры пружинными ножницами и введите катетер до ограничивающей бусины.

Завяжите шов за бусиной и убедитесь, что катетер работает, подключив свободный конец катетера к шприцу для отбора проб. Для установки артериального катетера сделайте небольшой разрез в пяти миллиметрах левее грудины и краниальнее первого разреза. Изолируйте левую общую сонную артерию, затем перевяжите краниальный конец.

Завяжите конец шелковой нитью, завязав рыхлый узел. Еще один фрагмент шовного материала наложите на проксимальный конец обнаженного сосуда. Затем зажимните каудальный конец сосуда.

Затем сделайте разрез чуть ниже лигированного конца с помощью пружинных ножниц. Осторожно введите катетер до зажима. Осторожно снимите зажим и продвиньте катетер к соединению Astic P.

Плотно завяжите лигатуры на катетере и убедитесь, что катетер работает, присоединив его свободный конец к шприцу для забора проб. Затем переверните животное и сделайте небольшой разрез между лопатками; с помощью иглы 14-го калибра проложите туннель под кожей от разрезов на передней части к этому разрезу на спине. Проденьте катетеры через иглу, чтобы вывести их на спину мыши.

Подсоедините артериальный и венозный катетеры к соответствующим коннекторам антенны мыши для обеспечения доступа к пробам или для установки masa. Затем введите masa в разрез между лопатками. Закройте оба разреза нейлоновой шовной нитью.

Подтвердите проходимость обоих катетеров. Поместите мышь в теплую чистую клетку для восстановления; дайте животному восстановиться в течение как минимум пяти дней до начала проведения инсулинового зажима. Самым сложным этапом при выполнении гиперинсулинемического эугликемического зажима у мышей является попытка поддержания эугликемии.

Мыши обладают очень быстрым метаболизмом, и уровень глюкозы в их крови может значительно изменяться в течение эксперимента. Требуется определенная практика, чтобы развить понимание того, как будут меняться уровни глюкозы у мыши на протяжении всего опыта, и определить, как корректировать скорость инфузии глюкозы для поддержания стабильной гликемии. Схема стандартного гипергликемического зажима представлена здесь.

Три системы Infuse Eight, содержащие глюкозу, инсулин и промытые эритроциты, присоединяют к четырехходовому коннектору, который соединен с поворотным механизмом (свивелем) и подвешен над мышью. Порт для инфузии свивеля соединяют с венозным катетером. Перед подключением мыши все линии Infuse Eight заполняют физиологическим раствором.

Затем заполните линию отбора проб гепаринизированным физиологическим раствором. Оставьте шприц с гепаринизированным физиологическим раствором подключенным к верхней части поворотного соединения, удалив воздух из шприца. Начните голодание мышей за пять-шесть часов до начала зажима.

Через три часа после начала голодания взвесьте мышь и подсоедините венозный и артериальный катетеры к линиям инфузии и забора проб соответственно. За 15 минут до начала зажима вставьте контрольный раствор глюкозы в ручной глюкометр. Затем наберите примерно 50 µl крови в промывочный шприц, чтобы удалить физиологический раствор из системы, и отсоедините промывочный шприц.

Измерьте уровень глюкозы в крови, прикоснувшись тест-полоской к капле крови, образующейся на конце трубки. Затем введите шприц с тупой иглой в линию отбора проб и наберите 50 µL крови. Перенесите кровь в пробирку с покрытием ЭДТА и центрифугируйте её для получения плазмы, необходимой для измерения базальных уровней гормонов и метаболитов.

На этом этапе снова введите шприц для промывки и потяните поршень на себя. Чтобы удалить пузырьки воздуха, введите обратно 50 µL крови, которые были отобраны изначально. Запишите значение глюкозы в крови, полученное на глюкометре.

Спустя 10 минут используйте глюкометр и шприц для очистки, чтобы повторно измерить уровень глюкозы в крови, а затем возьмите еще 50 µL крови для получения второго образца плазмы. После проведения повторных базовых измерений заполните инфузионные линии для глюкозы, инсулина и промытых физиологическим раствором эритроцитов до четырехходового коннектора. Подсоедините четырехходовой коннектoр к трубке, прикрепленной к вращающемуся инфузионному порту.

Начните с инфузии эритроцитов, промытых физиологическим раствором. Установите скорость инфузии таким образом, чтобы восполнить общий объем крови, отбираемой в течение исследования. Как только инфузия эритроцитов достигнет мыши, начните инфузии инсулина и глюкозы.

Это момент времени t = 0 минут. Инсулин вводится с постоянной заданной скоростью. Начальная скорость инфузии глюкозы рассчитывается на основании исходного уровня глюкозы в крови и предыдущего опыта.

В течение следующих двух часов измеряйте уровень глюкозы в крови с помощью глюкометра и корректируйте скорость инфузии глюкозы для поддержания целевой эугликемии. С интервалом в 10 минут фиксируйте новые показатели глюкозы и скорость инфузии глюкозы. На 100-й и 120-й минутах соберите дополнительный объем крови для измерения уровня инсулина в плазме, а также любых других гормонов или метаболитов. Здесь показана динамика уровней глюкозы на протяжении всей процедуры зажима (clamp), демонстрирующая, насколько стабильно поддерживалась эугликемия у мышей на обычном и высокожировом кормах в течение всего эксперимента. Динамика скорости инфузии глюкозы показывает, что скорость, необходимая для поддержания эугликемии, значительно ниже в группе, получавшей высокожировой корм, что указывает на нарушение действия инсулина в всем организме.

Уровни инсулина как натощак, так и при проведении гиперинсулинемического зажима, также выше в группе, получавшей корм с высоким содержанием жиров, что дополнительно подтверждает наличие фенотипа инсулинорезистентности. У этих мышей тритированная глюкоза используется для оценки скорости появления эндогенной глюкозы. Endo A является показателем продукции глюкозы печенью, тогда как у контрольных мышей инсулин полностью подавляет Endo A.

Супрессия нарушена у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров. Аналогичным образом, глюкоза TRID используется для оценки скорости утилизации глюкозы всем организмом. Способность инсулина стимулировать Rd снижена у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров.

2-дезоксиглюкоза, содержащая углерод-14, используется для оценки индекса метаболизма глюкозы RG, который является показателем тканеспецифического поглощения глюкозы. Как видно на этом примере, стимулируемое инсулином поглощение глюкозы скелетными мышцами нарушено у мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров. Как правило, специалистам, впервые применяющим данный метод, будет сложно выполнить микрохирургические операции, необходимые для имплантации артериальных и венозных катетеров.

Данная операция требует узкоспециализированных навыков и постоянной практики в течение нескольких месяцев для достижения высокого мастерства в проведении хирургического вмешательства для гиперинсулинемического эугликемического зажима; основной сложностью вновь является поддержание эугликемии у животной модели с очень высоким уровнем метаболизма.