Визуализация субклеточной динамики кальция в нейронах Caenorhabditis elegans

Возьмите два отдельных трансгенных штамма Caenorhabditis elegans на предметных стеклах с агаровыми прокладками. Подушечки содержат раствор для катания с паралитическим средством, которое сводит к минимуму движения.

Вентральный нервный канатик червей, или VNC, содержит возбуждающие интернейроны, которые экспрессируют цитоплазматические показатели кальция у одного штамма и показатели митохондриального кальция у другого.

Поместите покровное стекло для скручивания червей, ориентируя VNC для визуализации, затем поместите их под флуоресцентный микроскоп.

Используйте видимый свет, чтобы найти червей, затем переключитесь в режим флуоресценции.

В покоящихся нейронах низкий уровень внутриклеточного кальция удерживает показатели несвязанными, что приводит к слабой флуоресценции.

Спонтанная активность нейронов открывает потенциал-зависимые кальциевые каналы, обеспечивая приток кальция.

В штамме с цитоплазматическими показателями кальций связывается с показателями, усиливая цитоплазматическую флуоресценцию.

Избыток цитоплазматического кальция поступает в митохондрии по каналам. В штамме с митохондриальными показателями кальцийсвязывание увеличивает митохондриальную флуоресценцию.

Визуализируйте нейроны в обоих штаммах, чтобы контролировать динамику субклеточного кальция.

В стеклянной пробирке для культуры размером 13 на 100 мм приготовьте 3 миллилитра 10% агара, растворив молекулярный агар в M9, и разогрейте в микроволновой печи в течение нескольких секунд. Чтобы сделать агаровые подушечки, сначала подготовьте два предметных стекла, добавив два слоя лабораторного скотча. Затем поместите предметное стекло микроскопа между двумя предметными стеклами. Отрежьте кончик наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров и с его помощью нанесите небольшую каплю агара на центр покровного стекла.

Расплющите агар, нажав еще одной горкой вниз на верхнюю часть агара. После остывания разрежьте агар на небольшой диск с помощью отверстия 10-миллилитровой трубки, а затем удалите окружающий агар. Затем приготовьте раствор для скручивания червей, растворив порошок мусцимола в M9 для создания 30 миллимолярного запаса. Разбавьте массу в соотношении один к одному с шариками из полистирола, чтобы получился раствор для прокатки.

Чтобы расположить червячка для визуализации, сначала нанесите 1,6 микролитра раствора для скатывания на центр агаровой прокладки. Затем, используя предпочитаемую червячную кирку, перенесите червя нужного возраста в раствор для прокатывания на агаровой подушке. Подождите около пяти минут, пока мусцимол уменьшит движение червя, а затем опустите покровный стекло размером 22 на 22 миллиметра на верхнюю часть агаровой подушечки.

Для визуализации невритов в вентральном нервном канатике перекатывайте червя, слегка сдвинув покровное стекло. Чтобы установить червячок на микроскоп, нанесите каплю погружного масла на покровное стекло. Найдите червя с помощью объектива с малым увеличением в светлом поле. Затем переключитесь на 100-кратный объектив и определите местоположение неврита AVA с помощью подсветки GCaMP или mito-GCaMP с помощью лазера для визуализации с яркостью 488 нанометров.