Электропорация-опосредованная трансфекция ганглиев дорсальных корешков мыши для стимуляции регенерации сенсорных аксонов

Возьмем, к примеру, мышь под наркозом с обнаженными ганглиями заднего корешка L4 и L5, содержащими тела сенсорных нейронов.

Загрузите в пипетку для микроинъекций РНК-конструкции, помеченные флуорофорами, которые регулируют регенерацию аксонов, и индикаторный краситель.

Впрыскивать смесь в ДРГ.

С помощью электродов электропорации подайте электрические импульсы на ДРГ.

Это разрушает мембраны клеточных тел сенсорных нейронов, создавая поры, которые позволяют конструкциям проникать в цитоплазму, облегчая трансфекцию.

Зашите разрез и дайте мыши восстановиться.

Через несколько дней повторно проведите обезболивание и закрепите мышь.

Сделайте разрез сбоку от средней линии слева. Рассеките мышцы, чтобы обнажить седалищный нерв.

Раздавите нерв, чтобы травмировать аксоны сенсорных нейронов. Отметьте участок шовным узлом.

Зашите разрез и дайте мыши восстановиться.

Трансфицированный конструирует целевые мРНК в телах клеток сенсорных нейронов DRG, временно модулируя продукцию белка для улучшения регенерации сенсорных аксонов после травмы.

Для инъекции DRG загрузите плазмиды ДНК или олигоны РНК в стеклянную капиллярную пипетку. Затем осторожно вставьте кончик пипетки из капиллярного стекла в ДРГ. И постепенно вводите 1 микролитр раствора ДНК-плазмид или олигон РНК с помощью системы дозирования внутриклеточных микроинъекций.

Для электропорации следует аккуратно зажать целевую ДРГ электродами и подать 5-угольные электрические импульсы с помощью системы электропорации. Впоследствии закройте мышцу, затем кожу слоями капроновыми нитями. Через два-три дня после электропорации DRG обезболите мышь внутрибрюшинно, прикрепите ее конечности к пробковой доске и сделайте разрез в 1 сантиметр в 0,5 сантиметра слева по средней линии.

Затем разрежьте мышцы, такие как большая ягодичная мышца и грушевидная мышца в продольном направлении. Затем обнажите сегмент седалищного нерва между большим седалищным отверстием и седалищной выемкой. Раздавите нерв микрохирургическими щипцами в течение 12 секунд и отметьте место раздавливания нейлоновым эпиневральным швом. После этого закройте мышечные и кожные слои нейлоновым швом.