Субретинальное введение вирусных векторов в пигментный эпителий сетчатки на мышиной модели

Начните с мыши, находящейся под наркозом, и нанесите средство, расширяющее зрачок.

Под микроскопом откройте веко и слегка выпячивайте глаз, чтобы обнажить место инъекции.

Нанесите каплю офтальмологического вязкоэластичного раствора, затем наложите покровную накладку для визуализации сетчатки.

С помощью тонкой иглы создайте отверстие за соединением роговицы и склеры, избегая повреждения кровеносных сосудов и хрусталика.

Через это предварительно проколотое отверстие введите тупой шприц по касательной в субретинальное пространство рядом с пигментным эпителием сетчатки или РПЭ, который поддерживает нейроны сетчатки.

Введите лентивирусный вектор, несущий гены-мишени, в субретинальное пространство.

Наблюдайте за формированием субретинального пузыря из-за скопления жидкости, подтверждающего успешную доставку вектора.

Аккуратно закройте веко, чтобы закрыть место инъекции и дать мышке восстановиться.

Лентивирус проникает в РПЭ через эндоцитоз, высвобождает свой генетический материал и преобразует его в соответствующую ДНК, которая интегрируется с геномом хозяина, обеспечивая экспрессию генов.

Сначала приготовьте микролитровый шприц с тупой иглой 33 калибра. Простерилизуйте его с помощью газообразного окиси этилена. Затем приготовьте разведение вирусных векторов в PBS в микропробирке с концентрацией около 1 миллиона титровых единиц на микролитр. Теперь, при загрузке шприца, промойте его несколько раз раствором, чтобы удалить все мертвые места в шприце. Подготовьте от 1,5 до 2 микролитров для инъекций.

С помощью подготовленной инъекции вирусного вектора обезболите взрослую мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции тилетамина, золазепама и ксилазина. Подтвердите, что животное было обезболено отсутствием рефлексов. Как только анестезия будет подтверждена, расширьте ее зрачки каплей на 0,5% фенилэфрин и 0,5% тропикамид. Теперь под операционным микроскопом откройте веко и вытяните глаз, чтобы обнажить экватор. Удерживайте глаз в этом положении, расположив пальцы за пределами орбитального ободка.

Далее нанесите офтальмологический вязкоэластичный раствор на поверхность роговицы и наложите на роговицу небольшую круглую покровную горку. Таким образом, можно просматривать сетчатку глаза. Теперь, немного позади лимба и ниже в правом глазу или выше в левом глазу, используйте стерильную полуиглу 30-го калибра, чтобы сделать небольшое отверстие. Временно расположенные отверстия или отверстия в носу не являются хорошим выбором, так как их трудно закрыть.

Во время прокола не задевайте лимбальный сосуд или линзу, а также не вводите весь скос иглы.

Для субретинальных инъекций векторную иглу вводят через отверстие под углом 45 градусов к плоскости радужной оболочки. Протолкните иглу кзади к перипапиллярной области, следуя указанному пути, чтобы пересечь полость стекловидного тела. Приближайте иглу к субретинальному пространству до тех пор, пока не будет ощущаться легкое сопротивление, которое указывает на то, что слой РПЭ достигнут.

Не проникайте в склеральную ткань с чрезмерным давлением, потому что игла должна быть размещена в потенциальном субретинальном пространстве. Если иглой проколоть ткань черепа с чрезмерной силой, она без сопротивления попадает в экстраокулярное орбитальное пространство.

Теперь аккуратно введите вирусный вектор в субретинальное пространство. Держите иглу очень неподвижно, чтобы предотвратить повреждение тканей, что жизненно важно. Затем так же аккуратно извлеките иглу. Теперь глазное яблоко можно отпустить. Должен быть виден субретинальный блеббинг, свидетельствующий о накоплении векторов. Наконец, осторожно закройте веко, чтобы закрыть место инъекции. Произойдет самогерметизация отверстия.