Генная терапия на основе вирусных векторов для восстановления слуха на мышиной модели

Возьмем, к примеру, щенка мыши, находящегося под наркозом, с генетически вызванной потерей слуха.

В этом состоянии волосковые клетки во внутреннем ухе не имеют транспортеров глутамата, что предотвращает упаковку глутамата в везикулы и его высвобождение.

При этом нарушается передача звуковых сигналов к слуховому нерву.

Побрейте мышь за левым ухом, продезинфицируйте и нанесите глазную мазь.

Вытяните шею и сделайте надрез.

Втяните жировую ткань и мышцы, чтобы обнажить височную кость.

Перфорируйте барабанную буллу, часть височной кости, и расширяйте отверстие, чтобы обнажить круглую оконную мембрану или RWM, тонкий барьер для внутреннего уха.

Проколите RWM и введите аденоассоциированный вирусный вектор, несущий терапевтический ген.

Вирусные частицы диффундируют и проникают в клетки волоска.

Внутри волосковых клеток вирусные частицы доставляют свой генетический материал к ядру, запуская выработку транспортера глутамата.

Это позволяет упаковывать и высвобождать глутамат, восстанавливая звуковую сигнализацию слухового нерва.

После подтверждения анестезии щипцом ноги побрейте левую заушную область и продезинфицируйте кожу мышей после родов 10-12 дня с 70% этанолом и повидон-йодом. Затем накройте глаза защитной офтальмологической мазью, а животное с вытянутой шеей расположите на грелке. Когда хирургическая подготовка будет завершена, разрежьте подкожную клетчатку маленькими ножницами, чтобы обнажить заушную мышцу. После втягивания жировой ткани на заднюю сторону разреза разделите мышцы справа и слева, перпендикулярно разрезу.

Чтобы обнажить височную кость. Используйте иглу 25 калибра для перфорации барабанной буллы. Отслаивание кости щипцами по мере необходимости для расширения отверстия и обеспечения доступа к базальному повороту улитки.

Затем расширьте отверстие настолько, чтобы можно было визуализировать стапедиальную артерию и круглую оконную мембрану. Аккуратно проколите мембрану круглого окна в центре боросиликатной капиллярной пипеткой. Просушите круглую оконную мембрану стерильной фильтровальной бумагой. Затем подождите пять-десять минут, пока отток жидкости стабилизируется.

На этом этапе будьте внимательны при удержании и продвижении пипетки, чтобы сделать круглое окно мембранной перфорации как можно меньше. В зависимости от использования микроскопа пипетку можно держать рукой или с помощью микроманипулятора. Как вы можете видеть здесь, мы держим пипетку рукой, так как микроскоп находится слишком близко к мыши, чтобы можно было использовать микроманипулятор.

Теперь наберите от одного до двух микролитров вируса в стеклянную пипетку с наконечником диаметром 15 микрометров и введите вирус в барабан Scala через то же отверстие, которое ранее было сделано в мембране круглого окна.