Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:59 мин. • August 7th, 2025
Заполните микропипетку смесью ДНК, содержащей плазмидные векторы, несущие интересующий ген, и краситель для слежения. Закрепите его в микроманипуляторе.
Поместите агарозный блок под микроскопом и поместите над ним эмбриональный срез мозга мыши со встроенными в агарозу корковыми интернейронами.
Опустите микропипетку и введите смесь ДНК в прогениторную область интернейрона. Отслеживающий краситель отмечает место инъекции.
Поместите еще один агарозный блок на электрод чашки Петри, а агарозный столбик — на защитный электрод.
Перенесите срез на колодку и выровняйте покровный электрод по месту инъекции.
Применяйте короткие электрические импульсы, чтобы временно проникнуть в клеточные мембраны, позволяя плазмидам проникнуть в ядро.
Инкубируйте срез в среде для поддержания жизнеспособности клеток.
Внутри ядра плазмида запускает экспрессию генов, производит целевой белок и модулирует функции предшественников интернейронов.
Для инъекции смешайте экспрессивную и контрольную ДНК вектора в концентрации 1 микрограмм на микролитр для каждого вектора и добавьте раствор быстрого зеленого материала в 1-м разведении от 1 до 10. Наполните стеклянную микропипетку внутренним диаметром 0,5 миллиметра и внешним диаметром 1 миллиметр 10 микролитрами смеси ДНК и загрузите микропипетку в пневматический инжектор пиконасоса. Поместите больший блок агарозы под стереомикроскоп и поместите срез, который нужно ввести, на кусочек агарозы.
Затем введите от 25 до 50 нанолитров в выбранную медиальную ганглионарную или каудальную ганглионарную область среза. Сразу после инъекции поместите небольшой агарозный блок на электрод чашки Петри и с помощью микрошпателя с плоским концом прикрепите агарозную колонку к подвижному электроду крышки.
Перенесите введенный срез с поддерживающей мембраной на агарозный блок и поместите верхний электрод с агарозной колонкой поверх выбранной области среза. Затем на область наносится гальваническое покрытие двумя 5-миллисекундными импульсами по 125 вольт с интервалом в 500 миллисекунд. После электропорации поместите срез с поддерживающей мембраной обратно в чашку для хранения и верните чашку в инкубатор для культуры тканей.