Развитие одностороннем порядке, пораженном 6-OHDA мышиной модели болезни Паркинсона

Общая цель данной процедуры — создание мышиной модели паркинсонизма. Для этого сначала подготавливают препараты для операции. Следующим шагом является установка хирургического оборудования, после чего проводится односторонняя операция по введению 6-гидроксидофамина с последующим надлежащим послеоперационным уходом.

Шесть животных с введенным 6-гидроксидофамином могут быть использованы для поведенческих экспериментов. В конечном итоге результаты показывают более 95% истощения запасов дофамина в одностороннем медиальном пучке волокон головного мозга. Двумя наиболее важными аспектами данной процедуры, на которые следует обратить внимание, являются, прежде всего, надлежащий послеоперационный уход для обеспечения выживаемости животных.

Во-вторых, тщательно подготовьте оборудование для инфузии 6-гидроксидофамина, чтобы обеспечить полное введение нейротоксина. Для начала этой процедуры простерилизуйте хирургические инструменты в автоклаве. Затем очистите все поверхности и оборудование изопропиловым спиртом.

Затем подготовьте условия для послеоперационного периода, оборудовав клетку для восстановления мышей бумажными полотенцами на дне. Поместите клетку под нагревательную лампу или на грелку, чтобы подготовить тележку для анестезии. Убедитесь, что подача кислорода подключена и открыта, а резервуар с изофлураном полностью заполнен.

После этого установите поток кислорода на 1%, а концентрацию изофлурана — на 2–4%. Следующим шагом является сборка аппарата для инфузии. Наденьте одну металлическую гайку RN на одну сторону трубки Peak, затем установите зажимную втулку Peak cup. Затем установите коническую втулку PFA; расположите втулки так, чтобы конус конической втулки PFA входил в ответную часть зажимной втулки Peak cup.

Затем поместите сопряженную пиковую чашку и стандартный PFA-ферул в любой из концов двойного малого концентратора RN-соединителя и затяните металлическую RN-гайку на другом конце двойного малого концентратора RN-соединителя. Вставьте инъекционную иглу 33-го калибра. Проденьте иглу через одну из металлических RN-гаек и затяните ее.

Убедитесь, что игла калибра 33 расположена под углом 180 градусов к двойному соединителю RN с малым патрубком. Затем на другой конец трубки Peak накрутите одну из металлических гаек RN, за которой следует феррула Peak cup. Затем вставьте каноническую PFA-феррулу в более глубокий паз второго двойного соединителя RN с малым патрубком и затяните металлическую гайку RN, чтобы закрепить соединение.

Затем в другой конец второго малого двойного соединителя RN вставьте переходник для малого концентратора RN, после чего затяните металлическую гайку RN переходника для надежной фиксации соединения. Сборка инфузионной системы завершена. Следующим подготовительным этапом является заполнение инфузионной системы.

Сначала заполните стерильной водой шприцы Hamilton объемом 250 мкл и 1 мкл. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха. Затем подсоедините шприц объемом 250 мкл к адаптеру-люру и нажмите на plunger шприца объемом 250 мкл так, чтобы вода вытекла через инъекционную иглу калибра 33 G на другом конце трубки.

Продолжайте прокачивать воду через систему, извлекая шприц объемом 250 µL из адаптера приманки. Оставив небольшую каплю воды на конце адаптера приманки, нажмите на поршень шприца объемом 1 µL до появления маленькой капли воды.

Убедитесь, что капля воды на одномикролитровом шприце соприкасается с каплей воды на адаптере-заглушке. Затем полностью вставьте одномикролитровый шприц в адаптер-заглушку и убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в соединителе с двойным Luer-Lock портом. Теперь закрепите аппарат для перфузии на стереотаксической раме, а соединитель с двойным Luer-Lock портом и инъекционной иглой 33G зафиксируйте зажимом инфузионного насоса на манипуляторе стереотаксической рамы.

Затем закрепите шприц объемом 1 мкл на перфузионном насосе. После этого запрограммируйте инфузионный насос на скорость введения 0,1 мкл/мин за 30 минут до начала операции. Взвесьте животное и запишите его массу.

Введите мыши смесь допамина гидрохлорида в концентрации 2,5 мг/мл и парлина гидрохлорида в концентрации 0,5 мг/мл внутрибрюшным путем в дозе 10 мл/кг. Затем поместите под ушные и резцовые зажимы нагревательный диск для поддержания температуры тела животного во время операции и установите животное на оптимальную высоту, соответствующую ушным и резцовым зажимам стереотаксической рамы, через 15 минут после инъекции смеси допамина гидрохлорида и парлина гидрохлорида.

Поместите мышь в закрытую камеру для проведения процедуры судорожного приступа. Анестезируйте животное путем вдыхания изофлурана. Животное считается достаточно анестезированным, когда оно не реагирует на сжатие задней лапы и у него отсутствует мигательный рефлекс.

Затем выбрейте шерсть на верхней части головы мыши. После этого поместите мышь в стереотаксическую раму. Установите резцовый фиксатор в пасть животного и наложите анестезиологическую маску на морду.

Затем отрегулируйте скорость потока изофлурана. Нанесите местный анестетик лидокаин непосредственно на кожу с помощью ватного тампона. Отрегулируйте резцовый фиксатор и наушники, чтобы выровнять верхнюю часть черепа.

Затем стерилизуйте кожу раствором Бетадина. После этого установите ушные чашечки. Ушные чашечки установлены правильно, если голова лежит полностью ровно и не смещается ни в одном из направлений.

После этого сделайте разрез вдоль срединной линии головы с помощью скальпеля и раздвиньте кожу. Просушите поверхность черепа марлевой салфеткой. Нажмите на plunger шприца объемом 1 µL и погрузите инъекционную иглу калибра 33G в пробирку объемом 1 mL с раствором 15 mg/mL.

Раствор 6-гидроксидофамина, закрытый алюминиевой фольгой. Медленно потяните поршень на себя, удерживая инъекционную иглу калибра 33 в растворе 6-гидроксидофамина. Затем поднесите кончик инъекционной иглы к B bgma и введите небольшое количество раствора 6-гидроксидофамина так, чтобы сформировалась маленькая капля.

Затем медленно опустите кончик инъекционной иглы. Когда бусина коснется bgma, прекратите продвижение иглы и зафиксируйте эти координаты. Отведите инъекционную иглу на два миллиметра в дорсальном направлении и переместитесь вдоль сагиттального шва в ростральном направлении к Lambda.

Когда игла окажется над Lambda, выдавите небольшое количество раствора 6-гидроксидофамина из инъекционной иглы, чтобы сформировалась маленькая капля. Затем медленно опустите кончик иглы к lambda. Как только капля коснется Lambda, прекратите продвижение иглы и зафиксируйте эти координаты.

Координаты медиально-латерального и дорсо-вентрального направлений должны быть идентичны для BMA и Lambda. Если это не так, соответствующим образом отрегулируйте резцовую фиксирующую планку. Для передне-задних координат и ушных фиксаторов для медиально-латеральных координат переместите иглу в координаты введения.

AP -1,2 мм, ML -1,1 мм относительно брегмы. Выдавите небольшое количество раствора из инъекционной иглы, чтобы образовалась маленькая капля. Опустите каплю на череп, чтобы отметить место, где будет сделано отверстие. Затем извлеките иглу и просверлите отверстие в черепе, используя иглу 25-го калибра.

Верните иглу в координаты инъекции и введите её на 5 мм в дорсо-вентральном направлении. Затем односторонне введите 0,2 µL 6-гидроксидопамина или плацебо в медиальный пучок переднего мозга со скоростью 0,1 µL/мин. После завершения введения 6-гидроксидопамина или плацебо оставьте иглу на месте ещё на пять минут для обеспечения диффузии из места инъекции.

После этого медленно извлеките иглу, зашейте разрез на скальпе тремя швами, затем подкожно введите 1 мл раствора Рингера-лактата. Наконец, снимите животное со стереотаксической рамы и поместите в клетку для восстановления до возвращения сознания. Спустя 15–21 день после операции по повреждению 6-гидроксидофамином.

Когда гибель клеток, вызванная нейротоксином, завершится, можно измерить количество спонтанных поворотов на 360 градусов, чтобы оценить эффективность поражения 6-OHDA. При данной поведенческой оценке мыши с истощением дофамина, индуцированным 6-OHDA более чем на 95%, демонстрируют значительно большее количество ипсалатеральных поворотов, чем мыши с частичным поражением 6-OHDA или подвергшиеся имитации операции. При сопоставлении уровней дофамина в SAL с процентом спонтанных ипсалатеральных поворотов у каждого животного было установлено, что у мышей с 70% или более ипсалатеральных поворотов после поражения 6-OHDA уровень дофамина в SAL снизился более чем на 95%.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как эффективно выполнять стереотаксическую контролируемую инфузию 6-гидроксидофамина для создания повреждений у мышей. Это приведет к истощению уровня дофамина более чем на 95%. Кроме того, вы должны понять, как проводить поведенческую оценку паркинсонизма у мышей.