Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

В этом видео показана процедура изучения влияния чистого стресса на адгезию бактерий. Во время тяжелой инфекции бактериальным патогеном, таким как хороший sirium mens, патоген достигает кровотока, он прикрепляется к клеткам хозяина и колонизирует их, в то время как под механическим напряжением от проточной крови после пролиферации некоторые бактерии отделяются и колонизируют новые участки, и цикл начинается заново для изучения факторов, влияющих на адгезию бактерий к клеткам хозяина. Эндотелиальные клетки вводятся в одноразовые проточные камеры и культивируются, чтобы позволить клеткам достичь слияния.

Добавляются флуоресцентные бактерии и экспериментально контролируется чистый стресс. С помощью шприцевого насоса под микроскопом отслеживается адгезия бактерий к клеткам-хозяевам и пролиферация. Полученные видео анализируются с целью определения влияния напряжения сдвига на процесс колонизации эндотелия.

Эта процедура может быть очень полезной для изучения патогенеза менингита Ницца, но она также может быть использована для других бактерий, которые подвергаются напряжению сдвига на протяжении всего процесса патогенеза. Этот метод может быть немного сложным, особенно когда дело доходит до введения пузырей в систему, что может быть проблемой. Так что сегодня демонстрировать процедуру будет мега, аспирант работает в моей лаборатории.

Эксперименты, описанные в этом видео, проводятся с использованием клеток, культивируемых в микропредметном стекле IDI шесть 0,4, состоящем из одноразового стерильного пластикового предметного стекла, содержащего шесть каналов длиной 17 мм и шириной 3,8 мм, которые имеют глубину 0,4 мм. Каждый канал имеет два порта доступа с адаптерами приманки, по одному на каждом конце для введения uve клеток, пипетки 30 микролитров из расчета один раз 10 на шесть клеточных суспензий в каждый из каналов. На предметном стекле дайте ячейкам прилипнуть в течение трех часов при температуре 37 градусов и увлажните инкубатор с атмосферой 5% CO2.

После инкубации добавьте еще 120 микролитров endo SFM. Для заполнения ячеек лунок должен образоваться субсливающийся монослой примерно через 20 часов. В то же время, полоса GFP, экспрессирующая приятный сириевый менингит на APL, бактерия является патогеном человека.

Поэтому любые манипуляции с этим микроорганизмом должны выполняться в учреждении второго уровня безопасности с обученным персоналом в халатах и перчатках, рекомендуется вакцинация персонала против используемой серогруппы. Вот сорт 8 0 1 3. Экспрессия GFP культивируется под контролем индуцируемой промоторной полосы ИПДГ.

Бактерии на GC BPL, содержащие добавки Kellogg и пять микрограммов на миллилитр хлорамфеникола в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов. После того, как культуры клеток млекопитающих приживаются, бактерии добавляются к клеткам-хозяевам в канале. При подготовке к проточному анализу с помощью инокуляционной петли соберите бактерии из чашки Петри, перенесите их в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую предварительно подогретую культуру эндотелиальных клеток с добавлением.

Средний эндо СФМ. Отрегулируйте оптическую плотность до наружного диаметра 600 0,05, разбавив образец в той же среде до конечного объема в пять миллилитров. Чтобы вызвать экспрессию GFP, добавьте IPTG до конечной концентрации в один миллимоляр и инкубируйте культуру в течение 120 минут.

В увлажненном 37 градусах Цельсия 5% CO2 инкубаторе с легким встряхиванием. Поместите микропредметное стекло с подготовленными ранее культивируемыми эндотелиальными клетками на предметное столико инвертированного микроскопа, оборудованного подогреваемой платформой для поддержания температуры образца на уровне 37 градусов Цельсия. Налейте в стерильный стеклянный динамик предварительно подогретый endo SFM с добавлением 2% FBS и наполните 50-миллилитровый шприц, потянув за поршень.

Входная трубка соединена с трехходовым стопорным краном. Далее подсоедините входную трубку к шприцу и нажмите на поршень, чтобы заполнить трубку средой. Осторожно подсоедините другой конец входной трубки к микрослайду с помощью прилагаемых соединителей под прямым углом.

Избегайте попадания воздуха в камеру. Поместите шприц на насос, затем поместите отрезанный одномиллилитровый шприц на имеющуюся прорезь на стопорном кране в качестве резервуара. Затем прикрепите выходную трубку к другому концу канала и осторожно заполните канал средой, надавливая на поршень шприца примерно на расстояние одного сантиметра от выхода камеры.

Измерьте бактериальный OD 600 и отрегулируйте до 0,15, а эндо SFM, содержащий 2% FBS, как и раньше, энергично переведите образец в вихрь, чтобы разрушить бактериальные агрегаты. Далее с помощью одноразовой пластиковой пастбищной пипетки перекачивают в резервуар 100 микролитров эндос фм, дополненных 2%-ной средой FBS. Затем отсасывайте 100 микролитров бактериального раствора сверху из вихревого раствора и добавляйте его в резервуар.

Осторожно поверните запорный кран, введите бактерии в камеру микростекла, чтобы обеспечить адгезию при наличии контролируемого уровня долевого напряжения. Введите эндо СФМ, содержащий 2% FBS, в камеру с помощью шприцевого насоса со скоростью 3,5 миллилитров в час в течение 15 минут. Это видео ускорено в 60 раз.

Реальная продолжительность – 10 минут. После этого шага можно оценить адгезию и отделение бактерий к клеткам-хозяевам в различных условиях, а также описать их в следующих разделах видео. Чтобы количественно оценить начальную адгезию отдельных бактерий к клеткам-хозяевам, начните получать изображения через 15 минут потока, пока жидкость все еще циркулирует, получите изображения 10 случайных полей, чтобы определить среднее количество адгезивных бактерий на отображаемое поле.

Начните с открытия программы для дня обработки изображений и откройте изображение для анализа. Начните с нажатия на меню изображения и выбора. Отрегулируйте яркость, контрастность.

Оптимизируйте визуализацию отдельных прилипших флуоресцентных бактерий на фоне, регулируя уровни интенсивности перемещением курсора. Затем в плагине проанализируйте меню счетчика ячеек. Откройте инструмент счетчика клеток, инициализируйте изображение, выберите объект, введите и нажмите на каждую отдельную бактерию.

В окне отображается общее количество бактерий. Наконец, экспортируйте данные для каждого изображения в Excel и Average, чтобы количественно определить среднее количество адгезивных бактерий на поле, чтобы измерить устойчивость отдельных адгезивных бактерий к потоку. После первых 15 минут проточной программы шприцевой насос настраивается на создание напряжения сдвига в диапазоне от трех до 100 центов на квадратный сантиметр в течение пяти минут.

По истечении пяти минут остановите поток и соберите и проанализируйте 10 случайных полей, как и раньше, чтобы определить среднее количество оставшихся бактерий на поле. После первых 15 минут потока отрегулируйте шприцевой насос в соответствии с выбранным напряжением сдвига. Дайте ему течь в течение нескольких часов, записывая изображения со скоростью один кадр каждые пять минут.

В идеале можно придерживаться нескольких положений, если микроскоп оснащен моторизованной XY-платформой. После видеомикроскопии устраните стресс, выключив шприцевую помпу. Немедленно получите два-три дополнительных изображения, а затем остановите последовательность получения изображений в программном обеспечении.

Пример размножения бактерий можно увидеть здесь. Наконец, для анализа изображений используйте меню настройки порога изображения J's для преобразования изображений в двоичные. Затем в меню «Анализ» в разделе «Задать измерение» выберите измерение площади.

Затем используйте инструмент анализа частиц, чтобы автоматически определить размер колоний. Большие микроколонии образуются на клеточной поверхности через пять-семь часов, независимо от того, поддерживается ли поток на этом этапе. Чтобы сначала измерить устойчивость микроколоний к потоку, получите два-три изображения обеих клеток с помощью фазового контраста и бактерий с помощью флуоресценции GFP.

Применяйте высокое напряжение сдвига в течение пяти минут и делайте флуоресцентные изображения с точностью до одного кадра каждые пять секунд. Остановите напряжение сдвига, выключив шприцевой насос. Получите два-три дополнительных изображения, а затем остановите последовательность получения изображений в программном обеспечении рядом со сбором среды для анализа покрытия.

Во-первых, снимите выходную трубку, стараясь не допустить опорожнения канала. Добавьте предварительно подогретую свежую среду, чтобы заполнить лунки. Затем снимите входную трубку и соберите оставшуюся среду с помощью микропипетки и переложите в микроцентрифужную трубку Чтобы удалить оставшуюся среду из канала, дважды промойте микростекло, добавив 120 микролитров PBS в канал.

Наклоняем затвор в два раза и выбрасываем медиум. Чтобы собрать зараженные клетки, добавьте 50 микролитров трипсин ЭДТА в микропредметное стекло и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов, чтобы отделить их от канала, и смешайте этот отделенный образец с суспензией, собранной на предыдущем этапе. После выполнения серийного разведения в планшете PBS 10 микролитровых фракций на сельскохозяйственные планшеты GCB и трижды инкубируют при 37 градусах Цельсия 5% CO2 в течение ночи.

На следующий день определяют количество колониеобразующих единиц для оценки отделения бактерий от микроколоний. Заразите клетки в проточной камере, как и раньше, при низком потоке 3,5 миллилитров в час через 30 минут, удалите несвязанные бактерии, увеличив поток до пяти миллилитров в минуту в течение двух минут, а затем вернитесь к низкому потоку 3,5 миллилитров в час и дайте инфекции продолжаться в течение двух часов. Затем каждый час собирайте каплю среды, выходящей из проточной камеры, в микроцентрифужную пробирку в течение четырех часов.

После того, как все образцы будут собраны, определите количество колониеобразующих единиц, как и раньше. Это графическое изображение начальной адгезии бактерий на клеточной поверхности. Каждая линия на графике представляет собой совокупное количество бактерий, связанных в данном поле в зависимости от времени.

Значения для трех полей указываются, чтобы дать представление об изменении поля к полю, которое ожидается после пролиферации на клеточной поверхности. Механическая стойкость микроколоний была проверена путем увеличения уровня напряжения сдвига до 10 динов на квадратный сантиметр, но в то время как микроколонии типа устойчивы, микроколонии, образованные мутантом таблетки V, разрушаются при увеличении потока. Этот мутант не может индуцировать ремоделирование плазматической мембраны под микроколониями и, таким образом, более чувствителен к увеличению напряжения сдвига после своего развития.

Этот метод проложил путь для других исследователей в области инфекционных заболеваний для изучения влияния напряжения сдвига на взаимодействие различных патогенов с различными типами клеток. Не забывайте, что работа с человеческими патогенами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как второй или третий уровень.