ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической

Основной целью этой процедуры является создание экономически эффективного и быстрого протокола молекулярного генотипирования, который может дифференцировать сорта Retta cylindrica, обычно называемые гонговой травой, которые не могут быть различимы только по морфологии. Это достигается путем предварительной идентификации и выделения ткани из представляющей интерес разновидности гоновой травы. Следующим шагом является извлечение ядерной и гипсовой ДНК из собранной ткани.

Затем полимеразную цепную реакцию проводят на экстрагированной ДНК с использованием специфичных для разновидностей праймеров, которые нацелены на различия последовательностей в области поворота LF PLA, а также на соответствующие положительные и отрицательные контрольные группы. Заключительным этапом является проведение гель-электрофореза на каждой из четырех реакций ПЦР для визуализации амплифицированных продуктов ПЦР. В конечном счете, сорт собранной гоновой травы определяется путем анализа полученного сорта, специфичного для ПЦР-продукта запрета на гель Инвазивные планы обходятся Соединенным Штатам примерно в 3,4 миллиарда долларов ежегодно, нанося существенный вред как сельскохозяйственным, так и природным ресурсам.

Дикий тип импарато Электрика, также известный как Коган, трава входит в топ-10 худших инвазивных сорняков в мире. Коган трава быстро распространяется в мононасаждениях, которые вытесняют местную растительность, и, в свою очередь, животные, которые зависят от этой местной растительности Трава GaN в настоящее время заражает 490 миллионов гектаров по всему миру и около 500 000 гектаров в Соединенных Штатах, а декоративный сорт ti Tus centrica широко продается под названиями tus Centrica. Арбра, красный Барен и японская кровавая грубость, как мы будем называть ее JBG. Этот сорт предположительно стерилен и неинвазивный, и считается желанным благодаря своему красному цвету листьев.

При определенных условиях японская кровавая трава может производить жизнеспособные семена и возвращаться к полностью зеленой форме, неотличимой от дикой травы. Как видите, они оба обладают зелеными листьями и крупнее, чем традиционные декоративные сорта с более крупными листьями. Кроме того, растения обратного и дикого типа имеют более крупные корневища, а декоративная разновидность увеличивает свой бесполый репродуктивный потенциал.

Реверсия осуществляет идентификацию только через морфологию. Непростая задача. Молекулярные методы позволяют точно различать инвазивные растения и растительные материалы, которые не могут быть идентифицированы с помощью обычных визуальных средств.

Молекулярные методы имеют решающее значение для защиты от распространения и интродукции инвазивных растений. Применение этого молекулярного протокола позволяет точно отличать японскую кровяную траву от травы Когана. Этот протокол может помочь предотвратить совместное появление с травой Коган и возможное образование жизнеспособных гибридов.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как амплифицированный полиморфизм длины фрагмента или анализ FLP и такие вещи, как секвенирование ДНК, заключается в том, что он обеспечивает очень экономичный и быстрый метод молекулярного генотипирования, который может легко различить разницу между диким типом травы коган и сортами японской кровяной травы. Демонстрировать технику будет Джозеф, студент нашей лаборатории. Сначала определите экземпляр с участка, где растет гоновая трава или японская кровяная трава, и их необходимо отличить друг от друга.

Кровавую траву японскую легко отличить от гона дикого типа по ярко-красным листьям. Тем не менее, японская кровавая трава почти неотличима от травы Коган, поскольку они оба имеют более длинные зеленые листья, большую площадь листьев и более крупные корневища, чем декоративная японская кровавая трава. Этот метод можно использовать на свежих, замороженных и недавно высушенных тканях листьев.

Если вы планируете хранить ткани для извлечения ДНК позже, лучшим методом является немедленное замораживание и хранение ткани при температуре минус 80 градусов Цельсия. Если необходимо сухое хранение, поместите салфетку в бумажный конверт и храните конверт в обезвоженном силикагеле или других активных осушителях при комнатной температуре. Если вы хотите использовать свежую ткань, убедитесь, что ДНК была извлечена в течение трех часов после сбора, чтобы предотвратить деградацию.

В этой процедуре используется мини-набор заводов DNEZ от Kyogen согласно инструкции производителя с одной незначительной доработкой. Здесь. Процедура была адаптирована таким образом, что используется более 100 миллиграммов свежей или замороженной ткани или более 20 миллиграммов сухой ткани. Сначала измельчите более 100 миллиграммов свежей или замороженной ткани листьев или более 20 миллиграммов сухой ткани листьев в мелкий порошок с помощью трех кругов жидкого азота с растиранием в охлажденной ступке и пестиком.

Взвесьте замороженный порошок из свежей или замороженной ткани в 100 миллиграммовых аликвот. Если использовать сухую ткань листа, то взвесьте порошок в аликвоты по 20 миллиграмм. После этого шага приступайте к экстракции ДНК в соответствии с инструкциями производителя с использованием спектрофотометра, такого как тест спектрофотометра NanoDrop, ДНК, качество и количество хороших выходов ДНК должны составлять от 50 до 150 нанограмм на микролитр с двумя соотношениями 60 на два 80 и 2 32 80, близкими к 2,0, как видно. Здесь.

Проведите электрофорез с использованием стандартного геля 1% AROS. Проверьте наличие относительно больших полос размером более 10 КБ без или с небольшими полосами от загрязнения РНК, если концентрация ДНК высока, разбавьте образцы до 70 нанограммов на микролитр для последующих этапов. Праймеры для ПЦР, используемые в этом протоколе, обозначены красными и зелеными стрелками, основаны на различиях в последовательностях между загипсованной областью LF-спейсера травы Когана и генотипами японской кровяной травы.

Эти различия проявляются в виде однонуклеотидных полиморфизмов и вставок и делеций, обозначенных вертикальными черными стрелками, что позволяет разрабатывать специфичные для сорта праймеры. Путем расположения праймеров в сайтах уникальных последовательностей, последовательности праймеров содержатся в письменной части протокола для каждого изолированного образца ДНК, настроенных на две 50-литровые ПЦР-реакции в тонкостенных ПЦР-пробирках объемом 0,2 миллилира на ICE с использованием каждого набора праймеров в соответствии с письменным протоколом. Если концентрация ДНК низкая, в каждую реакцию можно добавлять больше ДНК, регулируя при этом количество дважды дистиллированной воды без нуклеаз так, чтобы общий объем реакции оставался 50 микролитров.

Не используйте более пяти микролитров ДНК или 10% от общего объема на одну реакцию, так как примеси, содержащиеся в образцах ДНК, могут ингибировать ПЦР-реакции, чтобы убедиться, что все ПЦР-реагенты работают, хорошо настроен положительный контроль. Используя положительные контрольные праймеры, установите отрицательный контроль с использованием того же набора контрольных праймеров, что и положительный контроль, но с двойной дистиллированной водой вместо экстрагированной ДНК на этом этапе, всего проводится четыре ПЦР-реакции для каждого тестируемого образца. Далее проводят амплификацию ПЦР в термоамплификаторе, оборудованном крышкой с подогревом, с использованием параметров циклирования ПЦР в письменном протоколе, может потребоваться оптимизация для прайм-колена, температуры, времени продления и количества циклов в зависимости от качества ДНК-праймеров, липкой полимеразы или типа используемого термоамплификатора.

После завершения реакций ПЦР разделите продукты ПЦР на 1%-ном геле с помощью стандартного электрофореза. Запустите образцы при напряжении около 120 вольт, пока фронт D не достигнет трех четвертей общей длины геля. Визуализируйте гель под воздействием ультрафиолетового излучения и осмотрите полученные полосы, чтобы увидеть, был ли амплифицирован соответствующий фрагмент ДНК.

Этот репрезентативный гель показывает результаты электрофореза продуктов ПЦР, полученных из образцов ДНК травы Когана, японской кровяной травы и ДНК японской кровяной травы в сочетании с травой Когана и специфическими праймерами JBG, а также положительный контроль LF и отрицательный контроль без матрицы. Набор грунтовок для положительного контроля поворота LF одинаково хорошо работает для травы Когана, японской кровавой травы, японской кровавой травы и других трав, и в результате получится полоса из 890 пар оснований. Если все реагенты для ПЦР не содержат ДНК-загрязнителей, отрицательная реакция контроля не приведет к получению продукта ПЦР.

Если образец ДНК получен из дикой травы когана, реакция ПЦР с использованием набора праймеров, специфичных для травы Когана, приведет к образованию одной полосы примерно из 595 пар оснований, в то время как специфические праймеры JBG не приведут к отсутствию полосы. Аналогичным образом, если образец ДНК получен в результате JBG или обратной реакции J-B-G-A-P-C-R, использование специфического набора праймеров JBG приведет к получению одной полосы примерно с 594 парами оснований. В то время как грунтовки для травы Когана не приведут к образованию полосы.

Поскольку JBG и обратный JBG имеют идентичную последовательность нуклеиновых кислот, они, следовательно, будут иметь идентичные паттерны полосатости. Тем не менее, морфологические различия между JBG и возвратами JBG довольно очевидны, поэтому, хотя результаты ПЦР будут одинаковыми, сорта JBG легко различить на уровне растений. Секвенирование ДНК продуктов ПЦР может выявить возможные изменения в последовательностях ДНК для различных экотипов травы когана.

Разработка этой методики обеспечивает первый упрощенный молекулярный метод, позволяющий точно различать дикий тип К и траву и вернутую форму ее декоративной разновидности японской кровавой травы. Мы рекомендуем пользователям этого протокола связаться с нами, чтобы сообщить о результатах, полученных в результате использования этого протокола. Такая общая информация поможет предоставить информацию о распространении японской кровяной травы.

Это также поможет регулирующим органам в Министерстве сельского хозяйства США принимать обоснованные решения о действиях, которые могут потребоваться для предотвращения распространения и потенциальной гибридизации высокоинвазивных сортов травы Коган