RNAi опосредованного Нокдаун гена и трансгенез по Микроинъекция в Necromenic нематода Pristionchus расШсиз

Общая цель данной процедуры заключается в успешной трансформации чужеродной ДНК и нокдауне функции гена у нематод Priyanka Pacificus. Для трансгенеза начните с подготовки соответствующей геномной ДНК с совместимыми когезивными концами.

Для РНК-интерференции синтезируйте интересующий ген с помощью набора для транскрипции двухцепочечной РНК. Затем проведите микроинъекцию ДНК или двухцепочечной РНК в гонады PRIs DIANCA pacificus. Проведите скрининг популяции F1 на наличие выбранного маркерного фенотипа при трансгенезе и отберите особей с фенотипом нокдауна для РНК-интерференции при трансгенезе.

Продолжайте мониторинг результатов анализа трансгенных червей второго поколения (F2) для получения данных о специфической экспрессии генов с использованием GFP-репортера методом флуоресцентной микроскопии. Здравствуйте, меня зовут Рэй Хонг, я представляю Университет штата Калифорния в Нортридже; в данной демонстрации будут описаны этапы генетических манипуляций с конкретными видами нематод. В развивающемся модельном организме проведение РНК-интерференции (RNAi) и трансгенеза позволяет ответить на ключевые вопросы биологии развития и поведения путем характеристики функций и экспрессии генов.

Лицам, которые впервые используют данный метод, будет полезно посмотреть, как помещать червя на подушечку для инъекций и как проводить инъекцию в правильной фокальной плоскости, где видны гонады. В отличие от других, гонады SCA специфичны, так как они перекрещиваются дорсально и смещаются по мере развития нематоды из поздней стадии J4 во взрослых особей. Кроме того, для приготовления смеси для инъекции к вашим трансгенам и маркеру ко-инъекции следует добавить геномную ДНК, переваренную соответствующими рестрикционными ферментами.

В данной лабораторной работе Джессика продемонстрирует метод микроинъекций в случае PRIs специально для трансгенеза. Для инъекции требуются 3D-конструкции ДНК, включая доминантный маркер ко-инъекции. Целевой репортерный трансген и геномные конструкции ДНК перевариваются совместимыми рестрикционными ферментами. Конструкции ДНК осаждаются с использованием протокола осаждения этанолом.

Инъекционная смесь готовится в концентрациях, указанных в таблице. Проверьте настройки манометра баллона с азотом. Теперь наберите в иглу от одного до двух микролитров инъекционной смеси.

Поместите иглу в манипулятор для микроинъекций. Сбейте кончик иглы, слегка коснувшись им края тонковытянутой капиллярной трубки, расположенной на предметном стекле, и установите ее в положение ожидания. Теперь налейте парафиновое масло так, чтобы оно покрыло планшет с четырьмя молодыми взрослыми червями.

Выберите одну червя и перенесите ее на планшет для инъекций. Под микроскопом расположите гонаду червя в направлении иглы, чтобы вульва была обращена в противоположную от иглы сторону. Теперь опустите иглу в положение, видимое в поле зрения микроскопа.

Совместите верхнюю гонаду и иглу в одной плоскости фокусировки. Аккуратно проколите червя и введите инъекционную смесь. Обратите внимание на смещение яиц к дистальному концу, что свидетельствует об успешном проведении инъекции.

Переместите иглу для инъекции в нижнюю гонаду и повторите впрыскивание. Поскольку эта гонада находится под кишечником, распространение яиц не будет видно, и поэтому оценить успех инъекции сложнее. Тем не менее, после инъекции червь должен остаться целым, без выпирающих гонад.

Верните иглу в исходное положение. Добавьте каплю буфера M9, чтобы извлечь червя, используя бактерии OP 50 на скальпеле-петле. Коснитесь червя бактериями OP 50, чтобы он прикрепился к ним.

Теперь перенесите червя на чашку, на которой расположены капли OP 50 объемом 50 µL. Храните инъецированных червей при температуре 20 °C примерно четыре дня для откладки яиц и выращивания потомства F1. Затем проведите скрининг червей на наличие выбранного фенотипа.

Перенесите отдельные особи F1 с наблюдаемым фенотипом на новые посевные планшеты и храните при 25 °C. Наконец, для трансгенных линий перенесите отдельные особи F2 в индивидуальные планшеты. Последующие поколения храните при 20 °C.

Манипулирование функциями генов на уровне организма с помощью РНК-интерференции (RNAi) и трансгенеза являются ключевыми аспектами модели Ppac pacificus для эволюционной биологии развития; по сравнению с червем дикого типа слева, стабильная трансгенная линия F4 PPR L3 приводит к доминантного «роллеру» (roller), который демонстрирует экспрессию GFP в нейронах головы. Напротив, этот эксперимент с РНК-интерференцией создает мутантов PRL 1, у которых наблюдается полный нокдаун катящегося способа передвижения, обычно характерного для мутанта PRL 1 с усилением функции TU 92. После освоения метода каждая инъекция может быть выполнена за пять минут. Важно помнить, что все особи F2 из независимых трансгенных линий-роллеров F1 должны быть отобраны поодиночке для создания независимых линий F2 promi.

Это связано с тем, что экспрессия GFP в F₂ линиях оказалась крайне вариабельной, а передача фенотипа «роллера» не коррелирует с уровнем экспрессии G.