РНК Выделение Синегнойной палочки Колонизация мышей Желудочно-кишечный тракт

Основная цель данной процедуры — выделить общую РНК Pseudomonas aerogen, полученную из внекишечных слизистых оболочек (ЭКМ) мышей. Сначала собирают содержимое просвета кишечника, после чего проводят выделение бактериальной РНК.

Затем проводят обработку D-S и очистку РНК. В завершение определяют количество РНК и проверяют чистоту изолята с помощью биоанализатора и спектрофотометрического анализа. В итоге можно получить бактериальную РНК достаточного качества и количества для последующей экспериментальной оценки, например, с помощью QPCR, анализа, профилирования транскрипции или экспериментов по секвенированию РНК.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими способами, такими как экстракция тризолом, заключается в том, что он включает несколько этапов лизиса в крайне жесткой кислотной среде и этапы экстракции хлороформом для обеспечения высокого качества РНК. Визуальная демонстрация этого метода крайне важна, так как этапы лизиса и экстракции трудно освоить, поскольку в письменных протоколах часто опускаются мелкие детали, критически важные для успеха. Процедуру продемонстрируют Эдуардо Лопес Медина, postdoctoral fellow, и Меган Нойбауэр, менеджер лаборатории, оба из моей лаборатории. Перед началом сбора образцов IMSA очищает ступку из нержавеющей стали в бане с жидким азотом.

Затем после эвтаназии мыши линии C3 HHEN в возрасте от шести до восьми недель, колонизированной Pseudomonas aerogen, поместите животное в положение на спине на пенопластовую доску и обработайте брюшную полость 95% этанолом. Затем сделайте продольный разрез кожи по срединной линии от грудины до промежности. После этого разведите кожу и брюшину, чтобы открыть брюшную полость.

Теперь удалите всю слепую кишку с помощью пинцета. Удерживая слепую кишку над стальной ступкой, отсеките оба её конца диссекционными ножницами. Наберите в наконечник пипетки P 1000 один миллилитр буфера Sequel Flush 8 и вставьте наконечник в проксимальный конец слепой кишки.

Промойте содержимое восьми буферов для промывки сиквела и люминальное содержимое сиквела в стальную ступку. Теперь измельчите содержимое восьми промывок сиквела с помощью стерильного пестика.

Затем налейте этанол в контейнер с сухим льдом и поместите полипропиленовую коническую пробирку объемом 50 мл в ванну из смеси сухого льда и этанола. Перенесите измельченное замороженное содержимое люминальных отделов в коническую пробирку и храните пробирку при температуре -80 °C. Следующая серия этапов является самой сложной частью процедуры.

Учитывая сложный состав материалов, полученных из слепой кишки MI, для достижения приемлемого качества и целостности обязательно требуется повторная холодная экстракция филоформом; может потребоваться от трех до пяти экстракций, прежде чем исчезнет широкий интерфейс между водной и органической фазами. Перенесите один объем кислотного фенол-хлороформа в 50-миллилитровую центрифужную пробирку Oak Ridge. Плотно закройте крышку и затем прогрейте пробирку на водяной бане при 65 °C.

Налейте половину объема лизирующего буфера в 50-миллилитровый полипропиленовый конический центрифужный тубус и прокипятите буфер в течение пяти минут. Извлеките содержимое люмена SQL из хранения при температуре -80 °C, ненадолго согрейте пробирку, быстро растирая ее в ладонях, после чего добавьте в пробирку кипящий лизирующий буфер. Встряхните смесь для гомогенизации раствора содержимого люмена SQL в лизирующем буфере.

Кипятите лизирующий буфер и содержимое SQL luminal в течение пяти минут. Периодически перемешивая содержимое на вортексе, откройте центрифужную пробирку Oak Ridge с раствором фенол-хлороформа и перенесите в нее образец лизата SQL. Затем снова загерметизируйте крышку с помощью perfil и поместите пробирку обратно в водяную баню при 65 °C на 10 минут, встряхивая пробирку каждые две минуты.

Промойте образец при центрифугировании 2 500 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C. Затем аккуратно перенесите водную фазу в новую центрифужную пробирку Oak Ridge объемом 50 мл, избегая попадания белого интерфейса. После этого добавьте в новую пробирку равный объем кисло-фенол-хлороформного раствора.

Герметизируйте крышку с помощью парафильма и тщательно перемешайте содержимое, подвергнув пробирку вортексированию на высокой скорости. Продолжайте центрифугировать образец и переносить водную фазу в центрифужную пробирку. Если объем верхней водной фазы станет слишком малым, ее можно перенести в пробирку меньшего диаметра.

Продолжайте этот процесс до тех пор, пока между водной и органической фазами не исчезнет видимый белый интерфейс. Когда белый интерфейс исчезнет, осторожно перенесите водную фазу в новую центрифужную пробирку. Затем добавьте в пробирку равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта, плотно закройте крышку и тщательно перемешайте содержимое с помощью вортекса.

Затем, после повторного центрифугирования образца, перенесите водную фазу в коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл и добавьте равный объем изопропанола. После этого инкубируйте раствор при температуре -20 °C в течение не менее двух часов или в течение ночи. После инкубации образца центрифугируйте пробирку в течение 45 минут.

После обнаружения гелеобразного осадка на дне пробирки удалите супернатант. Теперь промойте осадок одним миллилитром ледяного 70% этанола, перемешав содержимое пробирки на вортексе, а затем центрифугируйте образец при 10 000 ×g в течение пяти минут при температуре четырех градусов Цельсия. В завершение удалите супернатант и переверните пробирку, чтобы осадок высох на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем ресуспендируйте осадок РНК в 200 microliters безнуклеазной воды. Сначала добавьте 20 microliters 10x буфера Turbo DNA в микроцентрифужную пробирку и осторожно перемешайте раствор. Затем инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 20 минут, после чего добавьте в пробирку 20 microliters ресуспендированного реагента для инактивации ДНК и тщательно перемешайте.

Теперь инкубируйте пробирку еще в течение пяти минут при комнатной температуре, периодически перемешивая содержимое. Затем осадите пеллет в микроцентрифуге при 10,000 ×g в течение 1,5 минут, после чего перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку. Добавьте к пеллету один объем холодного кисло-фенол-хлороформного раствора, а затем тщательно перемешайте раствор, используя вортекс в течение одной минуты.

После центрифугирования раствора в течение двух минут при 12 500 ×g перенесите водную фазу в новую пробирку и добавьте один объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом. Затем перемешайте раствор с помощью вортекса и снова центрифугируйте его при тех же условиях. Перенесите водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку.

Затем добавьте 0,1 объема трехмолярного ацетата натрия и 2,5 объема ледяного 100% этанола. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе. Инкубируйте образец при температуре -80 °C в течение 30 минут.

Затем после центрифугирования при 12 000 ×g в течение 30 минут при температуре four degrees Celsius удалите супернатант. В завершение промойте осадок one milliliter ледяного 70% ethanol. Удалите супернатант и высушите осадок на воздухе в течение 10 минут.

Затем ресуспендируйте осадок в 100 µL воды, свободной от РНК. Agilent Bioanalyzer представляет собой платформу на основе микрофлюидики для определения размера, количественного анализа и контроля качества ДНК, РНК, белков и клеток; при этом используется показатель целостности РНК, известный как индекс целостности РНК или RIN. РНК, экстрагированная с помощью данного протокола, характеризуется соотношением 260/280 в диапазоне от 1,7 до 2,0 и значениями RIN ≥ 7,0.

Слева представлен пример электрофореграммы бактериальной РНК, полученной с помощью биоанализатора Agilent, а справа — гелеподобное изображение Pseudomonas arosa, выделенной из содержимого SQL мышей. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как количественная ПЦР или секвенирование РНК, для получения дополнительных данных, например, для более детального профилирования экспрессии генов.