Отслеживание нейтрофилов внутрипросветный Crawling, трансэндотелиальной миграции и Хемотаксис в ткани Прижизненное микроскопии видео

Общая цель данного протокола заключается в использовании светлопольной интравитальной микроскопии и таймлапс-видеосъемки для изучения динамических взаимодействий нейтрофилов с эндотелиальными клетками в процессе привлечения нейтрофилов в ответ на действие хемоаттрактантов in vivo. В этом видео мы демонстрируем методику использования светлопольной интравитальной видеомикроскопии для визуализации и определения внутрипросветного перемещения нейтрофилов, их миграции через эндотелий и хемотаксиса в тканях мышц голени мыши. Привлечение лейкоцитов является основным признаком воспаления.

Этот процесс рекрутирования начинается, когда лейкоциты в кровотоке начинают перекатываться по эндотелию постካпиллярных вен в месте воспаления. В ответ на хемокины или другие хемоаттрактанты на поверхности сосуда эти катящиеся лейкоциты останавливаются и прочно прикрепляются к эндотелию. После адгезии многие лейкоциты перемещаются по просвету сосуда, по-видимому, в поиске оптимального места для трансмиграции.

После ползания лейкоциты перемещаются через эндотелий — этот процесс называется трансэндотелиальной миграцией. Затем нейтрофилы мигрируют в экстраваскулярной ткани по направлению к источнику хемоаттрактанта в очаге воспаления, что называется хемотаксисом. В данном видео демонстрируется эксперимент по использованию прижизненной видеомикроскопии в светлом поле, таймлапс-съемки и программы ImageJ для визуализации, отслеживания и определения параметров внутрипросветного ползания нейтрофилов, их трансэндотелиальной миграции и миграции при хемотаксисе в тканях скелетных мышц в ответ на источник хемоаттрактанта для нейтрофилов.

Здравствуйте, я Ли Лю из отделения фармакологии медицинского колледжа Университета Саскачевана. Сегодня мы покажем вам, как создать хемотаксический градиент для нейтрофилов в агарозе. Как подготовить мышцы голени мыши для intravital-микроскопии.

Как отслеживать перемещение клеток с помощью MEGJ. И, наконец, как анализировать параметры привлечения нейтрофилов. Два аспиранта нашей лаборатории, ngel Naja, sh и Chile, продемонстрируют вам детальные экспериментальные процедуры. Здравствуйте, я Naja Sh. Здравствуйте, я Chile.

Для начала этого эксперимента приготовьте хемоаттрактант для нейтрофилов в агаровом геле: сначала дозированно отмерьте 10 миллилитров 2× PBS в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Подогрейте пробирку, поместив ее в стакан с горячей водой. Дозированно отмерьте 10 миллилитров дистиллированной воды.

Добавьте 0,4 г порошка агарозы в коническую пробирку объемом 50 мл. Нагревайте смесь в микроволновой печи до закипания, чтобы приготовить 2% раствор агарозы в PBS. Добавьте теплый 2× PBS в пробирку с раствором агарозы.

Перемешайте полученный раствор круговыми движениями и поддерживайте его в теплом состоянии в стакане с горячей водой. Тщательно смешайте раствор хемоаттрактанта с тремя микролитрами туши «India Ink» в крышке микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 миллилитра. Избегайте образования пузырьков воздуха во время смешивания.

Отрежьте кончик наконечника дозатора на 200 µL и микропипетки. Перенесите 110 µL агрораствора при 42 °C в крышку и немедленно тщательно перемешайте. С помощью другого наконечника дозатора поместите этот гель, содержащий хемоаттрактант, в холодильник до использования. Анестезируйте взрослую мышь-самца путем внутрибрюшинной инъекции смеси ксилазина и кетамина.

Выбрейте область над правой наружной яремной веной и переднюю поверхность мошонки. При использовании электрической бритвы после введения анестезии важно уделять особое внимание и проявлять осторожность по отношению к анестезированной мыши. Для предотвращения гипотермии мыши можно использовать тепловую лампу.

Мышь должна быть свободна от болевого рефлекса. Сделайте горизонтальный разрез, найдите яремную вену и катетеризируйте её, используя трубку PE 10, заполненную гепариновым физраствором с концентрацией 100 единиц на миллилитр. Подключите доску к циркулятору воды с температурой 37 °C, чтобы поддерживать тепло мышцы кремастера и остальной части тела.

Зафиксируйте задние конечности мыши пупочными лентами, уложив животное спиной вниз на доску для выделения кремастерной мышцы. Сделайте разрез кожи мошонки, чтобы обнажить левую кремастерную мышцу. Осторожно отделите мышцу от прилегающей фасции.

Промойте мышцу, поднимающую яичко, подогретым до 37 °C бикарбонатированным физиологическим раствором. Завяжите шов 4.0 на дистальном конце мышцы, поднимающей яичко, чтобы зафиксировать её на прозрачном стеклянном основании доски для мышцы, поднимающей яичко. Проведите продольную коагуляцию мышцы, поднимающей яичко, используя коагулятор и шовный материал 4.0.

Расположите мышцу плоско и зафиксируйте её по краям на пьедестале. Отделите семенник и придаток семенника от подлежащей мышцы и переместите их в брюшную полость. Нанесите тонкий слой вакуумной смазки на противоположные края покровного стекла размером 22 by 22 millimeter.

Затем накройте открытую мышцу стеклянным покровным стеклом. Поместите основную подложку с мышцей на предметный столик микроскопа. Осмотрите мышцу под микроскопом и найдите подходящий посткопиллярный участок.

Выберите сосуд с нормальной скоростью сдвига и диаметром от 25 до 40 микрометров. Настройте видеокамеру так, чтобы сосуд был виден в вертикальном положении либо в правой, либо в левой части монитора. Через 30 минут запишите видеоизображения выбранного пост capillaряйного сосуда в качестве базовых контрольных данных с помощью устройства записи видео, такого как DVD-рекордер.

Это базовые контрольные изображения видеозаписи посткапиллярной венулы. Перед нанесением геля с хемоаттрактантом на поверхность кремастерной мышцы остановите суперфузию и снимите стеклянную покровную пластинку с мышцы; вырежьте из крышки епруфки кусочек геля с хемоаттрактантом размером один кубический миллиметр. С помощью обрезанного кончика наконечника пипетки объемом 200 µL поместите вырезанный гель с хемоаттрактантом на поверхность кремастерной мышцы в заранее выбранной области на расстоянии 350 µm от наблюдаемой посткапиллярной венулы.

Накройте образец покровным стеклом для фиксации геля и проведите суперфузию мышечной ткани с очень низкой скоростью, не превышающей 10 µL в минуту, чтобы обеспечить установление градиента хемоаттрактанта, который медленно высвобождается из геля. Записывайте видео в течение 90 минут после добавления геля, содержащего хемоаттрактант. В процессе записи отрегулируйте и поддерживайте фокус микроскопа на лейкоцитах, которые прикрепляются, ползают, трансмигрируют и осуществляют хемотаксис внутри сосуда и в мышечной ткани.

После завершения эксперимента импортируйте видеофайл на компьютер. Для анализа на компьютере извлеките видео и конвертируйте его в формат AVI. Например, используйте бесплатное программное обеспечение Bit Ripper для конвертации видео с DVD в файл AVI.

Используйте программное обеспечение для редактирования видео, например Windows Movie Maker, чтобы создать таймлапс-видео из исходного видео в реальном времени, после чего сконвертируйте и сохраните таймлапс-видео в формате DV AVI. Запишите изображения калибровочного микрометра при тех же настройках микроскопа. Импортируйте изображения на компьютер.

Откройте изображения в программе ImageJ. Измерьте размер экрана по осям X и Y и рассчитайте количество пикселей на микрометр. Чтобы импортировать видео, откройте ImageJ. Снова перейдите в меню «File» (Файл), выберите «Import» (Импорт), используя плагин QuickTime movies, выберите анализируемое видео и нажмите «OK» в интерфейсе окна открытия QT-видео. Перейдите в раздел «Plugins» (Плагины). Для отслеживания клеток с помощью «Manual tracking» заполните соответствующие поля в нижней части экрана перед началом отслеживания; перед началом процедуры должны быть определены следующие временные параметры.

Интервал в секундах представляет собой общее время таймлапса, разделенное на 30; калибровка по xy — это значение микрометра на пиксель, полученное при калибровке изображения микрометра; калибровка по Z установлена на нуле; размер квадрата поиска для центрирования равен одному. Необходимо выбрать на записанном видео стабильную и четкую точку в качестве опорной точки. Эта опорная точка может быть любой четкой и малой структурной точкой, которая остается неизменной и стабильной на протяжении всего эксперимента.

Нажмите «добавить трек» (add track), чтобы отследить контрольную точку от первого до последнего кадра. Затем нажимайте и отслеживайте ползающие и мигрирующие нейтрофилы по одному. Нажимайте «добавить трек», чтобы отследить клетку с момента её появления в ткани до её исчезновения в каждом кадре.

Затем нажмите кнопку «track», чтобы завершить процесс и сохранить результаты в Microsoft Excel. Откройте файл с результатами в Microsoft Excel. Приступайте к анализу данных.

Важно учитывать перемещения референтной точки при проведении анализа. При отслеживании миграции нейтрофилов по поверхности эндотелия и в просвете сосуда мы определяем расстояние и скорость этого перемещения. При анализе трансэндотелиальной миграции нейтрофилов мы измеряем время трансмиграции и время отсоединения нейтрофила.

При определении хемотаксиса нейтрофилов в тканях скелетных мышц мы измеряем расстояние и скорость миграции и хемотаксиса нейтрофилов в мышце, а также определяем индекс хемотаксиса при хемотаксисе нейтрофилов в мышечной ткани. Определения этих параметров, отображаемые на экране, подробно приведены в нашем письменном протоколе. В данном эксперименте мы демонстрируем процедуры использования прижизненной микроскопии в светлом поле для визуализации и определения интралюминального перемещения нейтрофилов, их эндотелиальной миграции и миграции при хемотаксисе.

Для ответа на хемоаттрактанты нейтрофилов in vivo мы использовали либо MIP-2, CXCL2, либо синтетический пептид W-K-Y-M-V-M, подготовленный в виде агарового геля, для индукции рекрутирования нейтрофилов в ткани мышц CMA мыши. Как видно из этого рисунка, MIP-2 в концентрации 0.5 µM и W-K-Y-M-V-M в концентрации 0.1 mM вызывали интралюминальное перемещение нейтрофилов с близкими скоростями. Трансэндотелиальная миграция нейтрофилов и их отсоединение от вены были сопоставимы по времени.

Эти два хемоаттрактанта также индуцировали миграцию и хемотаксис нейтрофилов в мышечной ткани почти с одинаковой скоростью и с аналогичными индексами хемотаксиса нейтрофилов. Интравитальная микроскопия является ценным инструментом для прямого наблюдения за процессом привлечения нейтрофилов и для количественного определения функций клеток и молекул на каждом этапе этого процесса. С помощью таймлапс-видеосъемки и программы Image J можно измерять интралюминальное переползание, трансэндотелиальную миграцию и хемотаксическую миграцию лейкоцитов в ткани при использовании светлопольной интравитальной микроскопии с применением селективных ингибиторов, трансгенных мышей и селективных хемоаттрактантов.

Данная система анализа может помочь выявить функции специфических белков в процессе рекрутирования лейкоцитов.